第四章-蛋白质的修饰和表达

蛋白质修饰的化学途径蛋白质修饰的分子生物学途径,第四章蛋白质的修饰和表达,一蛋白质侧链基团的化学修饰,化学修饰：通过选择性试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。巯基、氨基、羧基特别容易产生有用的取代,氨基的化学修饰P70,三硝基苯磺酸与赖氨酸残基反应，在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。亚氨代乙酰基：亚氨代乙酰化反应可区分-氨基和-氨基。完全亚氨代乙酰化的蛋白质仍保持在水溶液中的可溶性。-异硫氰酸苯酯在严格控制的条件下可对-氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于-氨基。,羧基的化学修饰P71,由于羧基在水溶液中的化学性知识的蛋白质分子中的谷氨酸和天冬氨酸的修饰方法很有限，产物一般是酯类或酰胺类。水溶性的碳化二亚胺类特定修饰羧基基团，可在较温和的条件进行,氧化和还原反应P70,5，5二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）（Ellman试剂），可与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放1个有很强颜色的TNB阴离子，可在412nm处通过光吸收的变化来监测反应的程度。Ellman是目前常用的定量测定蛋白质分子巯基数目试剂，还被用于探测蛋白质分子去折叠与再折叠时的构象变化状态及跟踪构象变化的过程。,氧化和还原反应P71,二硫键的还原：2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等。判断蛋白质分子中有无二硫键，是链内二硫键还是链间二硫键的方法可用非还原/还原双向SDS-PAGE电泳技术。处理后的蛋白很容易自动氧化，重新形成二硫键，因而需要经过羧甲基处理，防止重新形成二硫键。,化学修饰影响的条件,1、温和的反应条件是防止蛋白质分子变性的一个必要条件2、pH值变化：决定了具有潜在反应能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态。3、温度：影响活性巯基的微环境4、有机溶剂：试剂需要有机溶剂来助溶，但有机溶剂可使蛋白质变性。,二蛋白质位点专一性修饰,试剂对被修饰基团的专一性试剂对蛋白质被修饰部位的专一性,亲和标记,亲和标记：试剂（抑制剂）可以专一性的标记于酶的活性部位上，使酶不可逆的失活。具有底物类似的结构具有潜伏反应基团：被酶催化而活化，对活性部位起不可逆抑制作用,光亲和标记,光亲和试剂具有一般亲和试剂特点外，还具有一个光反应基团。反应过程第一步：试剂与蛋白活性部位在暗条件下发生特异性结合第二步：光照，产生一个高度活泼的功能基团，与活性部位的侧链基团反应,三蛋白质的聚乙二醇修饰,PEG：亲水、不带电荷的线性大分子、与蛋白质的非必需基团共价结合。作用：遮挡蛋白表面抗原决定簇，减少抗体的产生保护蛋白免受水解酶的作用影响蛋白活性,四蛋白质的化学交联和化学偶联,化学交联：交联剂为含双功能基团的化学试剂行成网状交联化学偶联：蛋白质分子偶联到化学惰性的水不溶性载体上，形成固定化蛋白质。,吸附法：利用各种固体吸附剂将酶或细胞吸附在其表面上，而使酶或者细胞固定的方法。常用吸附剂有活性炭、硅藻土、多空陶瓷、硅胶等。吸附法操作简便，条件温和，单结合力较弱容易脱落。包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。包埋法分为网格型和微囊型。常用包埋剂为琼脂凝胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶等。结合法：通过离子键或共价键使酶与载体结合的固定化方法。离子键法常用DEAE-纤维素等条件温和，结合力较弱。共价键法常用载体纤维素，琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等。此法结合牢固，但操作复杂，有可能影响酶活。而且必须首先激活载体。交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。常用试剂：戊二醛等。结合牢固酶活损失大。,蛋白质改造的分子生物学方法突变：寡核苷酸介导的定向突变、PCR方法、盒式突变定向进化：异错PCR、基因家族改组技术表达体系原核表达：大肠杆菌真核表达：酵母、昆虫、哺乳动物细胞,二、蛋白质改造的分子生物学途径,定位突变：在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片断优点：突变率高、简单易行、重复性好方法：寡核苷酸介导的定点突变、PCR方法介导的定点突变及盒式突变随机突变优点：在体外模拟自然进化的过程常用手段：易错PCR、基因家族改组技术（DNAfamilyshuffling)等,PCR方法介导的定点突变P77,通过改变引物中的某些碱基而改变基因序列，达到有目的改造蛋白质结构、研究蛋白质的结构和功能之间的关系的目的取代突变、插入突变、缺失突变,盒式突变,盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片断，取代野生型基因中的相应序列，设计成粘性末端步骤：1、将克隆片断用限制性内切酶切割2、将合成的寡核苷酸片断与酶切后的克隆片断混合3、产生突变基因产物,限制性内切酶,目标基因中要有适当的限制性内切酶位点：利用遗传密码简并性确保盒式突变序列的正确插入方向,寡核苷酸引物介导的定点突变,1、将待突变基因克隆到突变载体上2、制备含突变基因的单链模板;3、引物与模板退火，以5端磷酸化的突变寡核苷酸引物,与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA,4、合成突变链:在DNA聚合酶的催化下,引物以单链DNA为模板合成全长的互补链,而后由连接酶封闭缺口,产生闭环的异源双链的DNA分子;5、将异源双链DNA分子转化大肠杆菌后,产生野生型、突变型的同源双链DNA分子。可以用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学方法对突变基因进行筛选6、对突变基因序列进行分析,寡核苷酸引物介导的定点突变的改进,缺点：产生突变效率低，原因：大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统改进：KUNKEL用尿嘧啶取代DNA特点:1、采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体2、采用改进后的质粒，省去制备单链模板的步骤3、增加了多个抗生素筛选标志和相对应的多对敲除/修复引物，使质粒进行多次突变,U,U,U,U,U,U,3,5P,模板中尿嘧啶取代胸腺嘧啶,尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷菌株ung-dUTP酶缺陷突变体dut-,转染ung+,模板链降解,Kunkel方法,寡核苷酸引物介导的定点突变的改进,关键技术步骤：制备高质量的含U的单链DNA模板宿主：E.coliCJ236品系,3种方法优缺点比较,1、寡核苷酸引物介导的定点突变法优点：保真度比PCR突变法高，改进后的突变成功率大大提高缺点：操作过程复杂、周期长，待突变位点会受到限制性酶切位点限制2、PCR方法优点：操作简单，突变成功功率达100%。缺点：后续工作复杂，要与载体相连；TaqDNA聚合酶保真性低，要分析学列3、盒式突变优点：简单、突变效率高缺点：合成多条引物的成本较高,蛋白质定向进化,1993年，美国科学家ArnoldFh首先提出酶分子的定向进化的概念,易错PCR技术为代表的无性进化DNAshuffling为代表的有性进化,定向进化技术,人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本蛋白质（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化蛋白质,定向进化的原理,易错PCR技术(error-pronePCR)DNA改组(DNAshuflling)：由美国Stemmer于1994年首次提出一项体外重组技术随机引发重组(RPR)1998年,Arnold提出了一种有效的新方法交错延伸技术(StEP)：由Zhao等提出,是一种简化的DNAshuffling技术,随机突变的策略,易错PCR（errorpronePCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变连续易错PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变,易错PCR,改进的易错PCR方法：MgCl2浓度增加到7mmol/L稳定非互补的碱基对；加入0.5mmol/LMnCl2降低聚合酶的特异性；dCTP和dTTP的浓度增加到1mmol/L促进错误掺入；TaqDNA聚合酶量增加到5U以促进延伸链在碱基错配位置后得以继续。,DNA改组,DNA改组(DNAshuffling)又称有性PCR(sexualPCR)，原理如图所示,体外随机引发重组,体外随机引发重组(randompriminginvitrorecombination,RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度,交错延伸,交错延伸(staggerextensionprocess,StEP)在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度,定向进化的筛选策略,突变体分离,琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因微孔板悬浮法在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片微球细胞固定法与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选流式细胞计数法细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定,通过酶促反应的特征加入底物显色荧光共振能量转移同位素标记底物通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测,酶检测,信号探测,分光光度计和荧光酶标仪气相色谱和高效液相色谱质谱和核磁,定向进化与自然进化的异同点,定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。两者的不同：,进化动力不同：保守突变非保守取代；进化方向不同：适应突变的积累；进化速度不同：非常漫长只需几年、甚至几天；进化目标不同：适应环境超越生物学意义的要求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。,定向进化技术,Fig.1.Publicationrateofthedirectedevolutionarticlesinbiomedicalliteraturebetween1995and2004.TheanalysiswasachievedusingtheNationalInstitutesofHealthMEDLINEbibliographicdatabase.Thefigureshowsthetotalnumberofarticlespublishedeachyear,whichcontainthekeywordsdirectedevolutionintheirtitles.,定向进化的应用,基因融合,构建融合蛋白的基本原则是：将第一个蛋白基因的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白或多肽基因，即可实现两个基因的融合表达，融合蛋白具有衍生因子的双重活性。,基因融合P82,避免外源蛋白的快速降解：小肽使表达产物快速、有效的回收和纯化：分泌-亲和融合、双亲和融合法、分泌-插入融合法定向分泌：信号肽体外切割：改变外源蛋白的溶解性，防止包涵体的形成：与硫氧化还原蛋白形成融合体研究蛋白质结构功能,融合基因的构建的方法,PCR方法：基因通过合适的酶切位点直接剪接到适当的信号肽之后；将目标基因插入到信号肽和插入序列之间。融合蛋白接头的设计和选择Linker的长度一般在10-15AA之间；常为非极性的疏水AA（Gly、Ser）；常用序列（GGGGS）3,（二）融合蛋白标签肽标签方便重组蛋白纯化、蛋白质的检测和定向固定（三）融合蛋白报告分子报告分子是一类易于检测的蛋白质，将其与目的分子的基因融合，可以通过它的表达产物来标定目标基因的表达调控。,（四）蛋白质内含肽介导的蛋白质分子的连接内含肽（intein）：在蛋白质成熟过程中被剪切掉的一段框内融合与天体蛋白的氨基酸序列。,生物合成C端带有硫酯键或N端带有半胱氨酸的蛋白质分子,（五）tRNA接到的非天然氨基酸掺入,将目标蛋白质的基因重组入可用于体外转录的载体中利用寡核苷酸介导的位点特异性突变，将特定氨基酸的密码子突变为无义密码（TAG）利用runoff转录或化学/酶法反密码子环取代法合成相应的校正tRNA，将氨基酸连接在校正tRNA上通过体外转录体系，产生在特定位点突变成UAG的mRNA，通过体外反以体系，将非天然氨基酸掺入到蛋白质分子中的特定位点,外源蛋白表达体系,原核表达体系：大肠杆菌真核表达体系：酵母、昆虫、哺乳动物,原核表达体系,是外源基因表达的首选体系，只有在大肠杆菌中的表达产物由于不能正确折叠或缺少翻译后修饰而没有生物活性，或当天然蛋白质的回收率太低时，才考虑选择其它表达体系。优点：遗传学和生理学背景清楚；容易培养，高密度发酵；缺点：没有真核转录后加工的功能没有真核翻译后加工的功能表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体,表达载体的构建,复制起始点：据顶细胞内质粒的拷贝数选择性基因：转化体的确定、维持质粒的稳定性（LacZ，Amp）启动子：-10区（TATAAT）和-35区（TTGACA）核糖体结合位点：SD序列多克隆位点：多个单一酶切位点转录终止序列,如何改善外源蛋白的溶解性？外源蛋白的分泌表达细菌生长温度：改善在细胞质中表达蛋白溶解性的最简单方法是在诱导过程中降低工程菌的生长温度（降低到30度或更低）；通过用较弱的启动子减慢蛋白合成速率或利用部分诱导条件也可防止蛋白的错折叠和聚集，而使大量可溶蛋白积累。外源蛋白与分子伴侣和折叠酶共表达外源蛋白与相关蛋白或蛋白标签融合：如与硫氧环蛋白、His6标签等功表达可以增加外源蛋白的溶解性。,影响外源表达的因素,启动子结构对表达效率的影响较强的启动子（10%-30%）启动子控制的本底转录很低能由简单经济的方式诱导启动代表启动子：乳糖操纵子、T7,影响外源表达的因素,2转录终止区对外源基因的表达效率的影响机制：依赖Rho蛋白的转录终止依赖模板上的编码信号：新生RNA中的回文序列区和其下游4-9bp的dA和dT富含区。终止子是必须的,3mRNA的稳定性的影响用强启动子来弥补mRNA的不稳定4密码子的偏好性5表达定位6宿主选择对表达的影响7培养条件的控制对表达效率的影响,酵母表达体系,表达载体：Yep（酵母附加体质粒）和YCp（酵母着丝点质粒），二者都含有促进在酵母中自主复制的序列，或ARS序列元件。是多拷贝质粒甲醇酵母系统,外源蛋白质在酵母细胞中可以在蛋白质二硫键异构酶的作用下形成正确的二硫键。在酵母细胞中可以产生N-和O-连接的糖基化，从而糖组分与蛋白质分子共价相连。,哺乳动物细胞表达系统,哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。,哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染病毒载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞膜的相互作用使外源基因进入到细胞内。常用的病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、semliki森林病毒(sFv)载体等。质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体分为整合型和附加体型载体两类。整合型载体无复制能