粪菌移植对炎症性肠病大鼠血清TNF-α、IL8的影响

研究生：蔡景融导师：武华教授,2015年4月,粪菌移植对炎症性肠病大鼠血清TNF-、IL8的影响,专业：普通外科,研究方案,研究基础,研究计划及预算,国内外研究进展,选题依据,Content,粪菌移植对溃疡性结肠炎大鼠血清TNF-、IL8的影响,溃疡性结肠炎(UC)是一种病因和患病机制还未完全阐明，可能与微生态环境、黏膜的免疫应答、应激、遗传等因素有关的慢性肠道炎症性疾病，病变主要局限于结直肠粘膜及粘膜下层，可累及整个结肠甚至末端回肠。目前研究发现，与健康人相比，UC患者肠道中微生物的多样性减少约1/4，拟杆菌门与厚壁菌门在总菌群中所占比例明显减少，而放线菌门与变形菌门的比例明显增加。肠道菌群是机体一个特殊器官，其调节机体免疫、调控炎症、参与物质代谢等方面发挥重要作用。,粪菌移植（fecalmicrobiotatransplantation，FMT），是将健康人粪便中的功能菌群移植到菌群分布异常的患者胃肠道内，重建其健康的菌群分布结构，实现肠道及肠道外疾病恢复的一种治疗方式。现阶段，FMT研究大部分是关于FMT治疗复发性难辨梭状芽孢杆菌感染（CDI）和炎症性肠病（IBD）的个案或系列病例报道,但FMT导致患者肠道菌群具体发生何种有益变化及其潜在的机制仍不完全清楚，但有待进一步研究。对常规治疗失败或有手术禁忌证的UC病人，FMT或许是不错的选择。,肠道菌群的生理作用1.防御病原体的侵犯2.物质代谢作用3.生长与衰老4.合成维生素5.肠道的生物、免疫屏障作用,选题依据,传统的升阶治疗方案，序贯地应用5-氨基水杨酸、糖皮质激素与免疫抑制剂，无疑最为安全易行、经济实用；然而无限期地等待疗效，可能错失治疗良机，延误缓解时间，使约50患者仍处于活动状态，导致失用或致残的并发症，其疗效费用比反而降低。随着新药问世后治疗经验的积累，专家们提出早期、强力治疗，即降阶治疗方案。这种看似昂贵、危险，实则经济、高效的治疗方法已使相当多的IBD患者获益，但降阶治疗药物昂贵，又有一定风险，如严重感染、药物反应等，对非选择性病例也存在过度治疗之嫌，而且停药或减药后病情仍会发复发作，并表现出一定的激素依赖性。对常规治疗失败或有手术禁忌证的UC病人，FMT或许是不错的选择。目前FMT应用最为广泛的是治疗复发性难治性难辨梭状芽胞杆菌感染(CDI)肠炎，其短期缓解率可达90以上。FMT也在其他多种疾病中被用于试验性治疗，都取得了良好的效果，如IBD、IBS、肥胖、代谢综合征、糖尿病等。还有FMT被成功运用于系统性硬化病、帕金森病、慢性疲劳综合征和特发性血小板减少性紫癜等的个案报道。,国内外研究进展,1,检测指标及意义,3,实验方案,2,创新之处及可行性分析,4,研究方案,研究目标和内容,溃疡性性结肠炎大鼠模型建模成功评判标准,研究内容,拟解决的关键问题,1,2,3,研究目标,粪菌移植对溃疡性结肠炎大鼠血清TNF-、IL-8的影响,实验分组、建立溃疡性结肠炎的大鼠模型粪菌液的制备指标检测、Chiu氏6级评分法评估损伤程度,（1）分组情况（2）模型建立（3）粪菌液的制备（4）指标检测（5）Chiu氏6级评分法评估损伤程度（6）统计学分析,2,实验方案,2.1分组情况,健康SD大鼠54只，雌雄各半，体重200-250g，由山西医科大学生理实验室提供。随机分成3组：空白对照组(A组)、模型对照组（B组）、粪菌液模型组（C组），每组18只。其中A组为正常大鼠，给予无菌生理盐水保留灌肠，每天一次，自由饮水、进食。B、C两组为溃疡性结肠炎模型大鼠，分别给予无菌生理盐水、粪菌液保留灌肠，每天一次，自由饮水、进食。（生理盐水量、粪菌液量按体重换算）,2.2模型建立,大鼠造模前1d禁食24h，不禁水，称重后，3的戊巴比妥（1ml/kg）腹腔注射麻醉，52，4，6-三硝基苯磺酸(TNBSW/V)按100mg/kg加入等体积50%乙醇溶液；体位为头朝下，用聚丙烯管插入肛门上段8cm，注射器注人。再倒立15min左右，以防药液溢出，一次性灌肠。,2.3粪菌液的制备,粪菌液制备流程：将约5g供体（A组）新鲜粪便样本置于搅拌器中，加入25mL无菌09NaCl溶液进行初步均质加工；将粪便浆体经不锈钢滤网过滤去除其中的大颗粒物质；2h内将样本在氮气生物工程厨内进行称重并在匀浆器中进一步匀质处理；浆体逐级经过直径2浆体逐级经过直径20mm、10mm、05mm和025mm的不锈钢滤网过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质；将再次过滤的样本以6000转/min的速率离心15min，并将沉淀再悬浮于09NaCl溶液中，得几乎无色无味的粪菌液。获得的新鲜粪菌液可立即进行移植，也可加入无菌甘油后置于一80作为冰冻样本保存18周。,2.4指标检测2.5Chiu氏6级评分法评估损伤程度,分别于造模后3d、7d、11d每组各取6只大鼠，3戊巴比妥钠麻醉后开腹，使用一次性采血针穿刺门静脉取全血2ml，待低温离心后，再吸出上清液，置于一80冰箱中保存备用，采用酶联免疫法（ELISA）测定血清TNF-、IL-8浓度。取肛门以上8cm肠段卷起，置10中性甲醛中固定、石蜡包埋、切片、HE染色后显微镜下观察。并且于取材完毕后采用颈椎脱臼法处死相应大鼠。2.6统计学分析采用Spss13.0统计软件包进行分析，各组实验数据用均数标准差表示，血清学指标比较采用单因素方差分析，P0.05表示差异有统计学意义。,3,检测指标及意义,TNF-主要由脂多糖(LPS)激活的单核巨噬细胞产生，对免疫反应、机体代谢、炎症反应、抗肿瘤均有重要的调节介导作用。1.溃疡性结肠炎中TNF-分泌水平及其mRNA表达高于正常组或未受累结直肠粘膜。2.TNF-不仅能刺激巨噬细胞、纤维母细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和内皮细胞分泌花生四烯酸代谢物、细胞因子和蛋白酶，还能吞噬细胞产物和补体片段引起细胞坏死、间质中蛋白质破坏和水肿的发生，从而促进胃肠细胞的组织损害。3.TNF-可使中性粒细胞聚集，内皮细胞粘附分子上调以及增加上皮紧密连接的通透性和抑制上皮细胞的生长等，还可诱导结肠上皮细胞凋亡，破坏肠粘膜屏障，同时血管系统也遭到破坏，通过以上途径导致一系列溃疡性结肠炎典型的炎症病变。,IL-8是一种强而有力的中性粒细胞趋化和活化因子，由单核细胞、上皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞及T淋巴细胞在IL-1、TNF和外源性因子细菌多糖(LPS)的刺激下产生,其主要生物学作用是1.趋化并激活中性粒细胞,促进中性粒细胞的溶酶体酶活性和吞噬作用,对嗜碱性粒细胞和T细胞也有一定的趋化作用。2.临床试验发现IL-8在UC患者的肠黏膜上皮中高表达并且IL-8水平与结肠炎的严重程度呈正相关。,检测指标及意义,3,技术路线图,SD大鼠,空白对照组,模型对照组,血清TNF-、IL8浓度并取结直肠组织HE染色后光镜观察,数据SPSS13.0统计软件分析,粪菌液模型组,3、7、11天各处死6只大鼠,1导师对此项课题有系统、全面的认识与把握2.已初步掌握动物饲养及实验操作的基本要领3.山西医科大学实验中心具备本实验相关条件,创新之处及可行性分析,4,现阶段，FMT研究大部分是关于FMT治疗复发性、难治性炎症性肠病（IBD）的个案或系列病例报道,对常规治疗失败或有手术禁忌证的UC病人，FMT或许是不错的选择，但其作用机制尚不完全清楚,研究基础,（1）导师武华教授有深厚的学术造诣和丰富的临床经验，可为实验提供理论技术指导。（2）已参阅大量与课题相关的中英文文献及与本课题参考性较强的相关资料和理论。,我校生理实验室具备完成本实验的基本条件：高速冷冻离心机、均浆机、超低温冰箱、氮气操作厨、，可以满足本课题的需求。动物中心实验室有饲养动物的动物房和饲养条件。,1.给予粪菌水的UC大鼠与给予无菌生理盐水的UC大鼠相比，血清TNF-、IL-8检测值较小，说明前者的肠道炎症反应轻，通透性低，肠屏障功能相比后者较好。2.给予粪菌水的UC大鼠与给予无菌生理盐水的UC大鼠相比，结直肠损伤情况判定评分较低。,9月-3月,4月-8月,3月,文献查阅；资料收集；资料分析；撰写报告。,动物饲养，做好实验；收集实验数据。,整理资料；分析资料；统计分析；撰写论文。,经费预算,主要参考文献：,参考文献,1邱新运,刘玉兰.粪菌移植在疾病治疗中的应用进展.中华内科杂志.2014,2BorodyTJ，KhomtsAFecalmicrobiotatransplantationandemergingapplicationJNatRevGastroenterolHepatol，2012，9：88-963Ord6sI，EckmannL，TalaminiM，eta1UlcerativecolitisLancet，2012，380(9853)：160616194FrankDN，RobertsonCE，HammcM，eta1DiseasephenotypeandgenotypeareassociatedwithshiftsinintestinalAssociatedmicrobiotaininflammatoryboweldiseasesJ.InflammBowelis，2011，17：1791845BorodyTJ，KhorutsAFecalmiembiotatransplantationandemergingapplicationsJNatRevGastroentemlHepatol，20129(2)：88-966RoundJL，MazmanianSKThegutmicrobiotashapesintestinalimmuneresponsesduringhealthanddiseaseJNatRevImmunol。2009，9(5)：313-3237苏献恩，于文霞，王世宣中华内科杂志，1993：12：842.8IshignroYMucosalproinflammatorycytokineproductioncorrelateswithendoscopicactivityofulcerativecolitisJGastroenter011999；34：66ol.53,NO.11.,主要参考文献：,参考文献,9SongAL.TheseveritycorrelationofTNF-,IL-6andIL-8levelsinplasmainpatientswithulcerativecolitisandtheirclinicalsignificancesJ.ChinaPracMed,2008,3(36):3-4.10PearlDS,ShahK,WhittakerMA,etal.Cytokinemucosalexpressioninulcerativecolitis,therelationshipbetweencytokinereleaseanddiseaseactivityJ.JCrohnsColitis,2013,7(6):481-489.11EisemanB，SilenW，BascomGS，eta1FecalenemaasanadjunctinthetreatmentofpseudomembranousenterocolitisJ.Surgery，1958，44：854-85912FeingoldKR，MoserA，PatzekSM，eta1Infectiondecreasesfattyacidoxida