叶酸代谢能力基因检测操作流程

Mth fr c677t，mth fr a 1298c，mtrr a66g基因检测工作流程实验过程一、程序适用的仪器：普通PCR仪器样品要求：EDTA抗凝剂的静脉全血(100l)，室温下7天内，2 8 保存1个月内，-20 保存3个月内，5次以上冻融重复；DNA的浓度必须低于5ng/l，A260/A 280必须介于1.6和2.0之间。有血栓的样品用均质或组织研磨机研磨后，必须提取全血DNA。检查方法： (套件的检查本卡，阳性/阴性对照卡的徽标解释如下。m代表突变，WT代表野生型，c代表质量控制线，t代表检验线。)，以获取详细信息答：样品DNA的制备套件准备工作：1、使用清洗液BW-I: 50 ml测量仪，分别将35 ml绝对乙醇(分离纯)和35 ml异丙醇添加到清洗液BW-I试用瓶中，反转均匀混合，试用瓶上标记“添加酒精”和日期、备用。2、使用洗涤液BW-II: 50毫升量桶，将49毫升绝对乙醇投入洗涤液BW-II试瓶，通过反转均匀搅拌，试验瓶上注明“添加酒精”和日期、储备。3，蛋白酶k制备：去除蛋白酶k，在室温下解冻，搅拌涡流，然后准备。4、磁粒子准备：保证磁粒子旋流的均匀性。实践程序：1.将20 l蛋白酶k溶液添加到2 ml离心管底部。依次加入100 l全血、200 l分解液BL，用旋流振荡器将15秒(以下旋涡混合)混合56水浴20分钟左右。2.在第一阶段裂解处理样品中依次加入300 l结合液BI，25 l的磁性粒子(移动前应充分混合涡流)，均匀涡流，在室温下静置5分钟。自我分离5分钟，抛弃。3.从磁选机中取出离心管，添加400 l清洗液BW-I，均匀涡流，将磁选作为违法石(上下翻几次以清理离心管壁)，放弃上灯清理；重复此步骤以使用400l清洁液BW-I重复清洁。4.从磁选机中取出离心管，加入400 l清洗液BW-II，旋涡均匀混合，磁选优先清除(上下翻几次以清理离心管壁)，上灯化(抛弃所有可能的清洗液BW-II)。5.打开离心管罩，在室温下烘干5分钟。6.从磁选机中取出离心管，将100 l洗脱液ES添加到管中，均匀涡流，56 的水浴为5分钟。7.将离心管放在磁选机上，磁选优先于澄清。将上等液(分离和精制的DNA溶液)移至2 ml离心管直接用于下游实验，或在-20 储备。B: PCR扩增溶液的制备(1)每人需要2个反应。取两个无菌0.2ml PCR薄壁管，在PCR薄壁管盖上按顺序标记m，WT。(2)试剂在-20 到室温平衡状态下的瞬时离心力。向标记为m的管道添加29l放大流体(m)，向标记为WT的管道添加29 l放大流体(WT)。(3)分别在上述m和WT中添加1l反应液。将管帽盖上牢固后，漩涡很好地混合，使用了瞬时离心力。c:准备要测试的DNA样本上面显示的m，WT管道中分别加入3l的测试对象基因组DNA，添加17l ddH2O，使最终体积为50 l。牢固地盖上管帽后，均匀地混合涡流，瞬间离心力。D: PCR放大将PCR管插入PCR管，然后放大，如下所示：50 2分钟；955min；94 到30秒，60 到30秒，65 到1分钟(26 cycles)；65 10分钟；4霍尔德。去除PCR产品，保存在2 8 。e:测试卡测试实验从密封包中取出检验卡，将测试对象样品m和WT管的PCR产品分别落在测试卡的相应样品垫上，读取结果2 5分钟，20min不相信结果。f:质量管理(1)在检查结果中，阳性对照组在阳性对照组卡检查线(t线)中，阴性对照组在阴性对照组卡检查线(t线)中不要出现带。正常检查时，应定期进行阳性对照组及阴性对照组实验。(2)阳性对照实验：取2个无菌0.2ml PCR薄壁管，在PCR薄壁管盖上的M，WT，20l M阳性对照，20l WT阳性对照中的M，WT阳性对照中的M放大液29l和1l反应液，WT扩增液29l，1l反应液(3)语音控制实验：取两个无菌0.2ml PCR薄壁管，将m，WT，m放大液29l，1l反应液和WT放大液29l，1l反应液分别添加到标记m，WT的PCR薄壁管，20l语音控制，20lg:解释结果(下图，下表)如上图1所示，作为阳性对照进行PCR反应，检测PCR产物，检查线(t线)上出现阳性对照带；以阴性对照液为模板的PCR反应，PCR产物检测，检查线(t线)没有条带，而是作为阴性对照。如果语音样本出现属相，添加样本时可能没有及时更换吸入口，也可能有DNA污染，因此建议在操作中先准备阴性对照组，及时关闭PCR管帽。图2显示了MTHFR 677CC表示正常的野生形态。图3显示MTHFR 677TT成为等位基因对的第677个细胞素(c)成为胸腺嘧啶(t)，即纯突变。图4显示了MTHFR 677CT对抗基因中的第677个细胞素(c)是thymidine (t)，即异形突变，没有图5质量控制线(c线)带，或者质量控制线(c线)和检验线(t线)都没有条带，则无效测试操作错误或测试条损坏，因此可能无效。应该重新阅读说明书，用新的检查卡重新检查。如果问题仍然存在，您必须立即停止使用该批号产品，并与制造商或厂商联系。图2野生型图3纯突变图1阳性和阴性控制图5无效图片透视异型突变h:注意事项(1)实验室必须遵守PCR实验规范的要求分区工作，各分区项目不能相互使用，模板和放入底漆的吸管不能混合，每次添加样品后，必须更换吸头，建议使用无利伯剂、有过滤器的吸头。各地区的仪器、设备、工作服要独立使用。(2)该工具包用于体外操作。用户不要吸入试剂或直接接触皮肤。(3)使用此工具包之前，请仔细阅读文档并严格遵守文档要求。请打开包装，尽快使用。(4)使用此套件时，PCR系统为50l系统，应使用200l的PCR放大管。(5)套件中装有“PCR成分添加确认书”，在检测