玉米晚报叶斑病菌的荧光标记(GFP和DsRed)

.,报告人：陈茂功指导老师：周印富教授王晓鸣研究员林小虎教授,玉米弯孢叶斑病菌的荧光标记及其在玉米侵染过程研究,汇报内容,一.研究背景,玉米弯孢叶斑病发生与危害玉米弯孢叶斑病（Curvularialeafspot），又称黑霉病、拟眼斑病，在我国主要是由新月弯孢（Curvularialunata（Wakker）Boed.）引起，是继玉米大斑病、小斑病后又一主要叶部病害。,在我国，上世纪70年代起偶有发生。至80年代，随着气候变化和栽培制度变更，该病害逐步开始流行，相继蔓延到我国辽宁、北京、河北、河南、陕西、山东、吉林和天津等十余个省市。,叶片,叶鞘,茎,苞叶,弯孢叶斑病是突发性病害，发生蔓延迅速，严重时叶部病斑密集成片，病株率及病叶率高达100%。一般玉米减产20%30%，严重时减产50%以上，甚至绝收。,北京昌平严重弯孢菌叶斑病品种,农杆菌介导的遗传转化,农杆菌T-DNA转化真菌机制示意图,目前农杆菌介导的遗传转化已经成功用于多种真菌的遗传转化，其中包括子囊菌纲（48个种）、担子菌纲（8个种）、接合菌纲（4个种）和卵菌纲（3个种）。尤其那些传统方法很难转化的，如长蠕孢霉、双孢蘑菇、玉米大斑病菌、玉米弯孢叶斑病菌等。,用于病原菌在植株中侵染途径的研究用于植物病原菌及生防菌在植物根部的定殖研究作为报告基因用于抗病转基因植株的筛选用于病原菌致病基因表达活力的研究,荧光蛋白在植病中的应用,普通显微镜观察,荧光显微镜观察,玉米弯孢叶斑病抗性研究,抗性资源筛选方法：孢子悬浮液高压喷雾接种待玉米四叶期时，以接种液（Tween20：0.02%；无菌水）调节分生孢子浓度至1.0106个/mL，用高压喷雾的方法接种于叶片。,病级评价标准：1级叶片上无病斑或病斑面积5%；3级少量病斑（610%）；5级叶片上病斑较多，占叶面积（11%30%）；7级叶片上有大量病斑，病斑相连，占叶面积（31%70%）；9级叶片基本为病斑覆盖，叶片枯死；,目前对该病害研究主要集中在抗病品种与病菌变异和致病机理等方面，但对该病菌在玉米叶片上的侵染及发育过程仍不十分清楚。运用荧光蛋白（绿色和红色）标记新月弯孢，通过生理生化等指标的筛选得到与野生菌相近的转化子，利用转化子观察新月弯孢在玉米叶部的侵染过程，分析新月弯孢在抗感玉米中侵染过程的差异。,本文研究目的及意义,技术路线,二.农杆菌介导的新月弯孢转化,筛选抗生素的确定,头孢噻肟钠对农杆菌抑菌浓度的测定,潮霉素B对分生孢子萌发抑制浓度的测定,农杆菌介导转化因素的优化,共培养介质,受体材料,孢子萌发时间,共培养温度和时间,当弯孢病菌分生孢子萌发12h后，在25与农杆菌黑暗条件共培养48h，共培养介质以微孔滤膜时转化效果最佳，转化效率可达到100-110个转化子/106个孢子。,筛选用CM培养基所得到的转化子全为阳性，而以PDA为筛选培养基得到部分为假阳性；共培养时光照无影响。,转化子筛选菌落,单孢分离,转化子荧光观察,gfp标记的新月弯孢,DsRed标记的新月弯孢,转化子分子检测,荧光标记的新月弯孢菌株中hyg基因、gfp基因和DsRed基因的PCR检测,Southern杂交结果显示，大多数转化子为T-DNA单拷贝插入，且Southern杂交条带所处的位置各不相同，这说明T-DNA在基因组中的插入位点不同，没有明显的位点插入偏好。,转代四次后,转化子稳定性分析,三.转化子插入突变分析,转化子的生长特性,转化子在CM培养基的菌落形态,转化子R4、G2与野生菌株在PDA培养基的菌落直径测量,酸性,中性,碱性,转化子的产孢量、细胞壁降解酶,产孢量,纤维素降解酶,果胶酶,转化子的粗毒素、致病力,ClR1R2R3R4G1G2G3G4,ClR1R2R3R4G1G2G3G4CK,转化子发酵液体培养基的滤液,离体叶片针刺粗毒素后的病斑症状,转化子粗毒素产生的离体叶片病斑面积,转化子接种5d后寄主的病情指数,转化子插入位点分析,侧翼序列基因的比对,五.新月弯孢对玉米侵染过程,新月弯孢在感病材料中的侵染,J,荧光显微镜下新月弯孢的侵染过程,感抗材料侵染间差异,扫描电镜下新月弯孢的侵染过程,抗病相关基因转录水平差异,新月弯孢对玉米根部侵染,五.玉米弯孢叶斑病抗病资源筛选,对441份玉米种质资源进行了抗弯孢叶斑病鉴定，共筛选出表现高抗玉米材料8份（京05、选6、运42291、黄5、赤黄32、自3303、37、5003），高抗、抗、中抗、感和高感的比例分别为1.81%、12.01%、16.78%、55.34%和14.06%。自交系中抗病的材料所占的比例小于地方的品种资源中抗病的材料所占的比例。,全文结论,通过农杆菌介导转化法成功将荧光蛋白基因（gfp和DsRed）转入新月弯孢基因组中，并优化了转化条件。通过对转化子的致病性状（产孢量、细胞壁降解酶和毒素）等分析筛选获得与野生型菌株差异最小的转化子G2进行后续分析，DsRed更易引起突变体的出现。,亲和互作中，接种2h后分生孢子即可萌发，6h分生孢子的萌发率可达到90%，2448h能够观察到侵染丝从表皮直接侵入进寄主细胞。侵染丝在穿透寄主细胞壁时菌丝会有明显变细的现象；胞内菌丝形成后，细胞变形成了空腔，后期时整个细胞塌陷坏死。非亲和互作中，48h也能够观察到侵染丝从表皮侵入寄主，但侵染后菌丝在细胞间扩展慢；120h时寄主产生的病斑小且少。,对抗感自交系间抗病因子的分析表明，发现抗病相关基因在病原菌侵染1248h转录水平升高，且抗病自交系诱导表达时间早，表达量大，出现高峰时间也早。抗病材料出现细胞凋亡时间较感病材料早，推测抗病材料早期细胞凋亡是寄主本身抗性的反应。对441份玉米种质资源进行了抗弯孢叶斑病鉴定，共筛选出表现高抗玉米材料8份。,本文主要探讨了新月弯孢与玉米间的互作，表明玉米抗感反应的重要环节主要在病原菌侵染的1248h；还筛选出了部分高抗弯孢叶斑病的玉米资源，为进一步研究玉米抗病弯孢基因提供资源和时间点参考。,致谢,感谢王晓鸣老师，周印富老师，林小虎老