《基因工程相关技术》PPT课件.ppt

第八章基因工程相关技术,第一节RNAi第二节基因芯片第三节基因信息分析技术,90年代初，RichJorgensen设想，将更多的色素基因mRNA注入植物体，能使花朵的色彩更艳丽，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制，当时称共抑制（cosuppression)。,第一节RNAi,一、RNAi的发现历史,par21基因反义RNA,par21基因正义RNA,par21基因沉默,par21基因沉默,秀丽新小杆线虫(C.elegans),1995年美国康奈尔大学Guo,par21基因功能：控制极性的建立,1998年华盛顿卡耐基研究院Fire等,发现这种现象是由于在制备正义/反义RNA时混入了少量的dsRNA,纯化par21基因反义RNA,纯化par21基因正义RNA,par21基因沉默现象微弱,par21基因沉默现象消失,秀丽新小杆线虫(C.elegans),结论:dsRNA具有转录后抑制作用,二、RNAi的定义,RNAi(RNAinterference,RNAi)指将与内源性mRNA互补的dsRNA(doublestrandedRNA,dsRNA)导入细胞后,引起该mRNA特异性的降解，导致mRNA编码的基因不能表达，发生基因沉默。,切割,AssembleintoRISCComplex,SmallInhibitingRNA(siRNAs),PerfectBase-pairingtomRNA,AAAAAA,mRNACleavageandDestruction,21,dsRNA,Dicer,RISC(RNAinducedsilencingcomplexes)RNA诱导的沉默复合体,三、RNAi的原理,核酸酶,RNaseIII核酸酶,*DicerdsRNA的核酸酶属于RNaseIII核酸酶家族成员，称为Dicer，是一种ATP依赖性核酸内切酶。它包括2个催化区、1个解旋酶区及dsRNA结合区域，在进化过程中高度保守。该酶将dsRNA切割成长21-23nt,此片段的3端有2nt的突出尾。*RNA诱导的沉默复合体RNA-inducedsilencingcomplex(RISC),复合体由21-23ntdsRNA、核酸酶和mRNA组成。当RISC复合物形成，核酸酶降解mRNA。kb=千碱基kilobasent核苷酸nucleotidebp碱基对basepair,M7Gppp,AAAA,依赖RNA的RNA聚合酶,ProcessingofnewdsRNAbyDicer,M7Gppp,AAAA,四、RNAi的细胞内级联反应,SmallInhibitingRNA(siRNAs),RNAi基因表达的效应可以突破细胞的界限，在不同的细胞甚至生物体间传递和维持，并可传递给子一代。,五、RNAi的细胞间级联反应,InjectdsRNA,SeeRNAiresponsehere,六、RNAi的应用,1、防御病毒的感染：dsRNA出现在许多病毒（包括单链RNA病毒）感染的细胞内，诱发RNAi，封闭病毒生存和繁殖所必需的基因，产生抗病毒效应。,2、基因治疗：RNAi作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基因。,肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结构，传统技术诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA既可以产生多个基因同时沉默。,3、研究基因的功能：由于RNAi可以特异性抑制特定的基因，获得功能丧失，因此可用于功能基因组的研究。,基因打靶,七、SmallInhibitingRNA(siRNAs),siRNA是一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA。,切割,AssembleintoRISCComplex,SmallInhibitingRNA(siRNAs),PerfectBase-pairingtomRNA,AAAAAA,mRNACleavageandDestruction,21,dsRNA,Dicer,RISC(RNAinducedsilencingcomplexes)RNA诱导的沉默复合体,1、化学合成2、体外转录3、长片断dsRNAs经RNaseIII类降解(e.g.Dicer,E.coli,RNaseIII)4、PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达5、siRNA表达质粒载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs,八、SmallInhibitingRNA(siRNA)的制备,(A)LongdsRNA,(B)SyntheticsiRNA,(D)Plasmid-basedshRNAvector,(E)Virus-basedshRNAvector,(C)DicedsiRNA,Dicer,Microinjection,Dicer,shRNA,siRNA,Dicer,Transfection,Transfection,Transfection,polIIIpromoter,sense,sense,TTTT,spacer,19-29nt3-9nt19-29nt,shRNA,3U(1-5)5,CYTOPLASM,siRNAproducedinvitro,DNABased,siRNAproducedinvivo,第二节基因芯片,电子芯片,在硅晶体上制造出高达每平方厘米数百万个密集排列的各种电子元器件。,生物芯片（Biochip）,借用其集成的含义,利用微加工技术在面积不大的固体支持物上有序、密集排列一系列固定于一定位置的生物大分子如蛋白质、核酸等或加工出各种细微结构用于进行各种生化反应和分析，从而达到对基因、蛋白质、细胞等进行检测的目的。,基因芯片,蛋白质芯片,微缩实验室（Lab-on-chip）,芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标,生物分析仪器的微型化,大规模平行分析,细胞破碎、蛋白质电泳、过滤、DNA提取,样品制备芯片,PCR扩增产物检测,生化反应芯片,检测芯片,基因芯片（genechip）或DNA芯片（DNAchip）实质上是在固体支持物上高密度排列的DNA片段或寡核酸，所以又称DNA微阵列（DNAarray）或寡核苷酸微阵列（oligonuleotidearray）。,基因芯片发展历史,Southern&NorthernBlot,DotBlot,宏阵列,微阵列,基因芯片的理论基础：传统的Southernblot和Northernblot是将受检测的样本固定在尼龙膜上，再利用特定的已知探针来检测样本中是否存在互补的DNA序列。基因芯片的核心原理与Southernblot和Northernblot相同，只是相反将各种探针固化到基质上，用以检测受检样品中与各种探针互补的核酸物质的变化。,1样品制备2DNA提取3荧光标记4分子杂交5信号检测6点阵分析,DNA芯片的主要类型,按制备方式分：原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在特定部位原位合成寡核苷酸而制备的芯片。探针较短DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片。探针的来源较灵活,基因芯片实验室的组成1DNA芯片样品制备系统2DNA芯片制备系统碱基固相化学合成系统基因芯片微点阵制备系统3分子杂交系统4高密度微点阵检测扫描系统5图象分析系统,DNA芯片样品制备系统,DNA样品的提取纯化DNA样品的PCR扩增探针的合成与标记等,DNA点阵芯片的制作工艺主要分为两大类：（1）在芯片点阵上直接合成寡核苷酸如Affymetrix公司利用半导体工业中的光版印刷技术定位曝光点阵，在使用固相光化学合成法，并行合成高密度的寡核苷酸点阵。（2）用点样的方式生成用点阵式或喷墨式印刷法将纳升级的微量DNA溶液直接以阵列形式点放并固化在芯片载体上以制备DNA点阵芯片。,DNA芯片制备系统,在芯片点阵上直接合成寡核苷酸,1通过光刻掩膜曝光2去保护区域被激活3固相化合成1个碱基4通过另一个光刻掩膜曝光5引入另一个碱基6重复这一步骤,合成过程图解,固相光化学合成,用点样的方式生成,玻璃基质,基因芯片微点阵制备系统,光版印刷,分割封装,芯片成品,基因芯片自动杂交仪,分子杂交系统,基因芯片荧光侦测仪,高密度微点阵检测扫描系统,高密度微点阵分析软件,图象分析系统,世界著名商业杂志财富对基因生物芯片领域非常看好，它在其1997年的3月31刊中讲到：“微处理器使我们的经济发生了根本改变、给人类带来了巨大的财富、改变了我们的生活方式。然而，生物芯片给人类带来的影响可能会更大.”,喷墨打印技术,DNA测序:杂交测序（SBH）基因表达分析：基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达药物研究与开发：,cDNAmicroarrayexpressionpatternsofsmall(S)andlarge(L)神经元,基因表达谱（geneexpressionpattern),BiologicalSample,FunctionalInformation,红色上调黄色不变绿色下调,基因表达谱芯片的应用最为广泛，技术上也最成熟。这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因在mRNA表达水平的变化。它能对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同生理病理、不同刺激条件下的组织细胞内基因表达情况进行对比分析。从而对基因群在个体特异性、组织特异性、发育特异性、分化特异性、疾病特异性、刺激特异性的变化特征和规律进行描述，,进一步阐明基因的相互协同、抑制、互为因果等关系。有助于理解基因及其编码的蛋白质的生物学功能，并从已知生物学功能的基因推论未报道基因的生物学意义。同时，还可在基因水平上解释疾病的发病机理，为疾病诊断、药效跟踪、用药选择等提供有效手段。例如：急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表达谱芯片的研究。,基因芯片的优点,高通量大规模高度平行性快速高效高灵敏度高度自动化,第三节基因信息分析技术,基因信息分析是基因工程实验必不可少的部分。,基因信息分析的内容,核酸蛋白质序列的检索,核酸序列的分子量、碱基组成、碱基分布,序列变换,限制性酶切分析,克隆测序结果分析,基因的电子表达谱分析,核酸序列的电子基因定位分析,核酸蛋白质序列比对分析,cDNA序列的开放读码框分析,引物设计,一、核酸序列的检索,对已知核酸序列的检索是核酸序列分析的一个基本方面。常用的方法有两种:第一种方法:利用美国国家生物信息中心（NCBI）的Entrez检索系统(/Entrez/index.html)进行检索。第二种方法:使用SRS检索系统（SequenceRetrievalSystem）。SRS是欧洲生物信息研究所（EBI）开发的以WWW界面运行的数据库检索系统，是生物信息界应用最为广泛的数据库系统，目前在全球有40多个SRS服务器（http:/downloads.lionbio.co.uk/publicsrs.html），中国有5个,Entrez的核酸序列检索界面,对多个序列接受号进行批量检索，可在序列输入框中输入多个序列接受号，之间以空格分开。,SRS的详细使用方法可参见用户使用手册和SRS教程（http:/bioinfo.hku.hk/srsdoc/srsuser.pdf）（http:/bioinfo.hku.hk/srsdoc/srs.ppt）。,中国主要的SRS服务器机构数据库数目网址SRS版本号北京大学（PKU）7.0.2中南大学（SCUT）:9090/srs71/7.1.3中国微生物信息网（IM）7.1.1中国生物信息网（BioSino）15/srs71/7.1上海生物信息技术研究中心82/srs7/7.1（SCBIT）,二、核酸序列的基本分析,（一）分子量、碱基组成、碱基分布（二）序列变换（三）限制性酶切分析（四）克隆测序结果分析,（一）分子量、碱基组成、碱基分布,核酸序列的分子量、碱基组成、碱基分布等分析可通过一些常用软件，如BioEdit、DNAMAN等进行。,（二）序列变换,进行序列分析时，经常需要对核酸序列进行各种变换，例如反向序列、互补序列、互补反向序列、显示DNA双链、转换为RNA序列等。使用BioEdit或DNAMAN等软件可以容易地实现这些功能。在BioEdit中，这些功能集中在“Sequence”“NucleicAcid”，从中可以选择对当前序列进行不同方式的序列变换。,（三）限制性酶切分析,限制酶数据库（RestrictionEnzymeDatabase,REBASE）中收集了限制酶的所有信息，包括甲基化酶、相应的微生物来源、识别序列位点、裂解位点、甲基化特异性、酶的商业来源以及分开发表和未发表的参考文献（,1、限制酶数据库,2、限制酶分析软件,利用REBASE在线工具,利用REBASE在线工具对SARSCoV完成基因组（GenBank接受号NC_004718）进行的限制性酶切分析，显示限制酶名称和虚拟凝胶电泳结果。,BioEdit软件,BioEdit软件通过“Sequence”“NuclearAcid”“RestrictionMap”即可完成限制性酶切分析。,（四）克隆测序结果分析,1.测序峰图的查看,使用BioEdit和DNAMAN软件可实现这一功能。BioEdit可直接打开测序结果文件进行观看。,并将序列以文本或fasta格式输出,2.核酸测序中载体序列的识别与去除,在对测序结果进行进一步分析之前，必须将载体序列去除。使用NCBI的VecScreen系统（/VecScreen/VecScreen.html）可确定载体序列。下图显示使用VecScreen对一条长为688bp的序列进行识别的结果，从图中可看出，第137688位之间是非载体序列部分。,三、基因的电子表达谱分析,对未知新基因的组织表达谱的研究能够为该基因的功能研究提供重要参考信息。基因的电子表达谱分析原理是，将待分析的序列与EST序列数据库进行搜索，根据与待分析核酸序列具有高相似性的EST序列所对应的组织来源推断出该基因的组织表达谱。,利用NCBI的UniGene数据库可进行电子表达谱分析（/entrez/query.fcgi?db=unigene）,将待分析的序列利用Blastn程序进行序列同源性搜索，一般情况下可以从EST数据库中搜索到一批与待分析序列高度相似的EST序列。选择相似性打分最高的一条EST序列，检索UniGene数据库，得到相应的UniGene编号，之后就可通过参与形成UniGeneCluster的序列的组织/细胞来源间接地推断出待分析序列在何种组织中表达。,利用UniGene数据库进行基因的电子表达谱分析结果示例,四、核酸序列的电子基因定位分析,对核酸序列进行电子基因定位（即基因的染色体定位），通过所定位区带的相邻基因或基因簇间接地提示该基因的功能，是核酸序列分析的一个重要方面。,（一）利用STS数据库进行电子基因定位,序列标签位点（sequencetaggedsite,STS）是指染色体定位明确，并且可用PCR扩增的单拷贝核酸序列。dbSTS为GenBank的一个子库，所有序列标签位点的序列都保存在这个数据库中。自2001年3月19日，UniSTS（/entrez/query.fcgi?db=unists）取代dbSTS提供STS信息。利用STS数据库进行电子基因定位时，主要利用NCBI的电子PCR资源。,如果已知序列的接受号，可直接利用接受号对UniSTS进行检索,也可直接利用电子PCR资源（/sutils/e-pcr/），将序列提交,（二）利用UniGene数据库进行电子基因定位,获得待分析序列所对应的UniGene编号后，通过检索UniGene数据库，从定位信息便可得知待分析序列的基因定位。,（三）直接利用基因组序列进行电子基因定位,将待分析的序列对NCBI的GenBank数据库进行搜索，有可能直接获得待分析序列所对应的基因组序列，一步实现基因定位。一般方法如下：1.将待分析的序列对NCBI的GenBank数据库进行搜索；2.得到确定的基因定位后点击“L”按钮，观察基因在染色体上的位置。3.点击“Position”所对应的链接，浏览器中将显示详细的基因定位结果。,五、基于核酸序列比对分析的功能预测,（一）基于NCBI/Blast软件的核酸序列同源性分析,对核酸序列的首要分析是进行序列的同源性搜索，以便利用最新的数据库资源，确定待分析的序列是否为已知序列，以及它与已知序列相似性的高低。典型的分析是采用NCBI/Blast程序对GenBank中的非冗余数据库（non-redundantdatabase,nr）进行搜索（/BLAST/）,Blast程序包括：（1）blastn，用核酸序列检索核酸序列数据库；（2）blastp，用蛋白序列检索蛋白序列数据库；（3）blastx，用核酸序列检索蛋白序列数据库（基于核酸序列所有可能的6个不同的读码框）；（4）tblastn，用蛋白序列检索核酸序列数据库（基于核酸序列所有可能的6个不同的读码框）；（5）tblastx，用核酸序列检索核酸序列（表达）数据库（基于核酸序列所有可能的6个不同的读码框）。,（二）两条核酸序列之间的同源性分析,两条核酸序列之间的同源性分析可采用NCBI/Blast2软件进行（