胰酶消化贴壁细胞

附壁细胞的消化处理和注意事项是附壁细胞：在体外培养条件下必须粘贴在载体表面才能生长的细胞。 就像CHO细胞。 消化：使分散的组织和贴壁的培养物相互离解，或者从介质中解离，形成单细胞或者小细胞团的操作。 附壁细胞的消化，附壁细胞在培养瓶中生长成致密的单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成分被大量消耗，同时代谢废弃物也大量堆积，需要分瓶培养、扩增、传代。 与墙壁紧密接触的细胞如Hela、HepG2、CHO等，需要用细胞消化液消化后脱落分散，扩大瓶子。 常用消化液为胰蛋白酶、EDTA等，主要消化方式为：一、酶消化法(胰酶Trypsin )二、离子螯合剂(EDTA )、一、酶消化法(胰酶Trypsin )、一)胰酶消化原理：胰酶为蛋白酶。 通过在特定位置分解蛋白质，分解细胞膜上和培养皿壁结合部的蛋白质，使两者分离。 在这种情况下，细胞因其内部细胞骨架的张力和培养液的表面张力而变成球形。 细胞消化胰蛋白酶常用功浓度在0.25%，pH在7.2-7.4之间。 2 )酶消化法操作过程：(以下操作均须按无菌操作要求进行)，加入生长成致密单层细胞的细胞瓶原培养液0.25%胰酶溶液，按细胞瓶大小加入体积0.5ml以上(按培养器大小)使其充分浸润， 一般的消化时间约为1分钟到3分钟，用肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接)变为点状透明(形成细小的间隙)时，丢弃胰酶，加入适量的血清培养液中止消化，散布。 图示： CHO壁细胞，经48培养成致密单层，加入0.25%胰酶后细胞逐渐萎缩变圆，细胞间隙增大不致致密，细胞间隙增大不致致密，部分细胞维持正常形态，部分细胞缩小变圆。 细胞的基本皱纹变圆时细胞被吹响，细胞完全皱纹变圆时扔掉胰酶，加入培养基后轻轻摇动可以将细胞从细胞瓶壁上洗掉，细胞悬浊液用吸管吹走后可以继承，有经验，可以用肉眼观察壁上的半透明细胞层过度消化的话，很多细胞会脱落，丢失被丢弃的胰酶溶液，细胞会被破碎。 请注意，倒数第二、三步就扔掉胰酶，瓶子里残留的胰酶可以持续作用到最后阶段的消化程度，影响最小。 1.4冰箱中储藏的液体胰蛋白酶溶液溶解一周后使用。 胰蛋白酶有可能在4下开始分解，在室温下放置30分钟以上会变得不稳定。 2 .在使用胰酶细胞消化液的过程中，应特别注意消化液不受细菌污染。 3 .胰酶细胞消化液消化细胞的时间过长是不好的。 不那样的话细胞铺设后的生长状况会变差。 消化不足的话细胞很难从瓶子的壁上掉下来，多次吹也会损害细胞的活性。 4.37时，胰酶活性最强。 5、溶液中的Ca2、Mg2和血清中的非特异性胰蛋白酶抑制剂可以降低胰酶活力，加入血清培养基停止反应，常见问题：被胰蛋白酶消化后，细胞结块，原因是什么？ 消化时间不足吹打力不足胰酶消化液浓度不足胰酶自身问题细胞密度过高； 二、离子螯合剂： (EDTA )，1)EDTA消化原理：EDTA是一种螯合剂，由于细胞表面大部分与培养皿结合的蛋白质具有Ca2或Mg2，因此EDTA可通过螯合Ca2或Mg2加速细胞与培养皿的脱离。 2)EDTA消化液使用注意事项，1 .常用浓度为0.02%左右。 2 .弱碱性条件下才容易溶解，调配时必须调整酸碱度。 3.EDTA对PH值有显着影响，而且不能被中和，所以消化的细胞用PBS洗涤一次，适用范围是EDTA不破坏细胞表面分子，只与Ca2、Mg2进行螯合。 适用于检测细胞表面分子的细胞消化。细胞保存，细胞冷冻保存：细胞保存的主要方法之一。 利用冷冻保存技术将细胞低温保存在-196液氮中，使细胞暂时脱离生长状态保存细胞特性，必要时使细胞复活用于实验。 细胞复苏：解冻冷冻保存的细胞，进行传代培养。 要取得良好的冷冻保存和复苏效果，必须了解冷冻速度复温速度冷冻保护剂的冷冻保存温度、1、冷冻速度冷冻速度是降温速度，是活细胞能否冷冻到永久保存温度的主要因素。 冷冻速度过快或过慢会导致细胞损伤，如果不以最佳冷冻速度冷冻细胞，就不能达到最佳的冷冻保存效果。 2、复温速度的复温速度是细胞复苏时温度上升的速度。 冷冻保存的细胞恢复时，即使恢复速度不适当，冷冻生存率也会降低。 一般来说，复温速度越快越好，在37水浴中，12分钟内完成复温。 3、冷冻保护剂冷冻保护剂是指能够保护细胞免受冷冻损伤的物质，经常加入一定的溶液中调制，制成冷冻保护液。 常用冷冻保护剂： DMSO，4，冷冻保存温度冷冻保存温度为细胞可长期保存的深低温。 在这种温度下，细胞的生化反应非常缓慢或停止，但经过长期保存和复苏仍能保持正常的结构和功能。 从实际和效益的角度来看，液氮温度(-65196)是目前最佳的冷冻保存温度，DMSO :渗透细胞，提高细胞膜对水的渗透性，降低冰点，延缓冻结过程，使细胞内的水分在冻结前排出细胞外，在细胞外形成冰晶，减少细胞内的冰晶，减少冰晶对细胞的损伤。 DMSO的浓度必须为10%，即使低于该浓度也对细胞有毒。 有些细胞不能使用DMSO，可以使用甘油。 细胞冷冻保存程序，1 .细胞冷冻保存前24-48小时的传代培养，使细胞按指数生长.2.用胰酶消化后加入适量培养基，制成细胞悬浊液.3.加入新生牛血清.4.除菌过滤后的DMSO.5 .混炼； 6 .将悬浊液放入灭菌冻结管，1-2ml/支，严密封口后，注明细胞名. 7.4度放入冰箱30分钟后放入-20度冰箱，30分钟后放入液氮口，4小时后放入液氮保存。 8 .复苏细胞，检查细胞有无活力和污染，检查细胞复苏顺序，取出贮藏细胞，在37水浴中迅速溶解，立即在完全生长培养基上铺装细胞。 冻存细胞1ml使用1020ml的完全生长培养基。 24小时细胞贴在墙上后，请