微生物鉴定常用的生理生化试验实验报告

山东大学实验报告2017年12月4日_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ uKe mu:微生物学实验标题：微生物鉴定常用的生理生化检验名称：丁志康一、目标要求1.通过证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，证明不同微生物有不同的酶体系。2.掌握微型生物聚合物水解试验原理和方法。3.理解糖发酵的原理和肠道细菌鉴定中的重要作用。掌握糖发酵对不同微生物的鉴定方法。5.了解IMViC反应的原理及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。二、基本原理1、生物不直接利用大分子的淀粉、蛋白质、脂肪，只有被生成的细胞外酶分解大分子物质，才能被微生物吸收利用。细胞外酶是水解酶，所以放入水，分解的物质可以通过小的化合物传递给细胞。糊精、双糖类和单糖，如淀粉水解为小分子的淀粉酶；脂肪酶水解脂肪成甘油和脂肪酸；蛋白质的蛋白酶水解是氨基酸等。这些过程都可以通过观察细菌群殖民地周围的物质变化来确认；如果淀粉遇到碘，就会产生蓝色，但细菌水解淀粉的部位不是产生蓝色，而是通过碘量法可以知道细菌产生淀粉酶。脂肪酸水解后，通过改变脂肪酸的pH值降低pH值，添加培养基中的中性红色指示剂，培养基从鲜红色变为深红色，意味着细胞外脂肪酶的存在。2、糖发酵试验往往是确认微生物的生化反应，对肠道细菌的识别尤为重要。大部分细菌利用糖分作为碳源和能源，但分解糖分的能力大不相同。有些细菌分解糖，产生有机酸(例如乳糖、乙酸、丙酸等)和气体(例如氢、甲烷、二氧化碳等)。有些细菌产酸，不产煤气。例如，大肠杆菌可以分解乳糖和葡萄糖，产生酸和气体。伤寒不能分解葡萄糖产生酸气，不能分解乳糖。乳酸菌分解葡萄糖，产生酸气体，不能分解乳糖。发酵培养基中含有蛋白胨、指示剂(溴甲酚紫色)、倒置的德汗小管和其他糖类。发酵产酸时，溴甲酚紫色指示剂可以从紫色(pH6.8)变成黄色(pH5.2)。气体的发生可以通过倒置的德汉小管中是否有气泡来证明。3、IMViC反应是吲哚测试、甲基红测试、伏-福测试、柠檬酸测试4种测试的首字母缩写。这四个实验主要用于快速查明大肠杆菌和产气菌，并主要用于水细菌检查。(1)吲哚测试：一些细菌着色氨剂从蛋白胨分解色氨酸，形成吲哚(靛蓝色基质)，吲哚呈玫瑰吲哚和红色，用于二甲基氨基苯甲醛。(2)甲基红测试：一些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖，产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸、乙酸、丁二酸等，从而使培养基pH降低到4.5以下，并添加甲基红指示剂，可以显示红色。如果细菌分解葡萄糖，产生较少的酸，或产生的酸进一步转化为其他物质，例如酒精、醛、酮、气体、水，培养基pH值超过5.4，甲基红指示剂也加入橙色。这个实验经常与V-P检查一起使用，因为前者是阳性细菌，后者通常是阴性。(3)伏-福(双乙酰)试验：有些细菌转化为葡萄糖丙酮酸(脱羧基乙酰甲基甲醇 2，3-丁烯二醇)，有碱的时候就氧化成双乙酰，后者和胯部的胍化合物可以工作，产生粉色化合物。这项测试的目的是测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。(4)柠檬酸测试：如果细菌以铵盐作为唯一的氮源，柠檬酸盐作为唯一的碳源，细菌可以用氮源和碳源生长，则可以使用柠檬钠生成碳酸盐，与铵盐生成的氨反应形成NH4OH，使培养基碱化，将指示剂溴麝香酚蓝(BTB)从浅绿色变成深蓝色三、设备1.菌株：枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，产气细菌，铜绿假单胞菌，普通变形菌，金黄色葡萄球菌。2.徽章：固体淀粉培养基，蛋白胨培养基，葡萄糖蛋白胨培养基，葡萄糖发酵培养基，乳糖发酵培养基。3.溶液或试剂：革兰氏染色用卢戈里皮奥多尔，甲基红试剂，v. p .试剂，吲哚试剂。4.仪器或其他仪器：无菌平板、无菌试管、接种环、接种针、试管架、酒井灯、小玻璃管。四、程序(a)淀粉水解试验(1)将固体淀粉培养基熔化后，冷却到约50 ，通过灭菌操作制作板。(2)用标记笔在板底部绘制为四个部分。(3)分别在不同的点接种芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌单细胞细菌，在板面的另一侧各写上细菌名称。(4) 37温度箱中反向培养板。(5)观察各种细菌的生长情况，打开瓣膜，将少量卢戈碘滴在扁平的盘子上，轻轻旋转盘子，使碘均匀地扩散到整个平板上。如果细菌苔藓周围出现无色透明源，则意味着淀粉被水解，呈阳性。透明圈的大小最初可以判断出该细菌产生淀粉酶水解能力的强弱，即细胞外淀粉酶活性的高低。(b)糖发酵试验1.试管外墙上用记号笔分别标记发酵培养基的名称和正在接种的细菌的名称。2.取葡萄糖发酵培养基试管3种，同样以大肠杆菌、一般变形菌、第三种接种为对照组。接种后轻轻摇动试管，均匀摇动，防止倒置的小管进入气泡。3.接种的和用作对照组的6个试管都以37 培养了2448h。4.观察试管颜色变化和德汗小管中是否有气泡。(c) IMViC测试(1)免疫和培训用接种环分别提取大肠杆菌和产气菌株，在5个葡萄糖蛋白胨培养基、3个蛋白胨培养基上分别标记培养基名称和菌株名称，放入37 培养基中培养48h。(2)观察结果1，吲哚试验：培养48小时后，在蛋白胨培养基上滴上34滴醚，摇晃多次，静置1分钟，沿试管壁慢慢加入2滴吲哚试剂。乙醚和培养物之间的红色环是良性的。2，甲基红测试：培养48小时后，将2滴甲基红试剂添加到葡萄糖蛋白胨水培养基中，培养基为红色的人为阳性，黄色的人为阴性。(注意，甲基红不要太假，以免产生假阳性。)，以获取详细信息3，伏尔-福试验：培养48小时后，在其他两个葡萄糖蛋白胨水培养基中加入510滴40%KOH，加入等量的5% -萘酚试剂，冲击，在37温控器中保温1530分钟，提高反应速度，培养菌红色五、实验结果(a)淀粉水解试验(左上角是Bacillus subtilis左下角是产气菌。右上角是大肠杆菌；右下角是蓝绿色的假单胞菌)(*由于金黄色葡萄球菌的残留较少，实验中细菌残留较多的气体生产菌被替代)观测结果如下：观测者：丁志康种菌Bacillus subtilis大肠杆菌青绿色假单胞菌煤气生产淀粉水解效果(阳性，即细胞外淀粉酶的产生；数量表示透明圆的大小，透明圆越大)(b)糖发酵试验实验结果如图所示。左边的三个试管各是乳糖发酵培养基接种大肠杆菌，蛋白质组，空白对照组。右边的三个试管分别是葡萄糖发酵培养基接种大肠杆菌，蛋白质组，空白对照组。观测结果如下：观测者：丁志康种菌大肠杆菌普通变形细菌对照葡萄糖-乳糖-(阳性的情况，-阴性的情况；第一个网格表示是否生产酸，第二个网格表示是否生产煤气)(c) IMViC测试(图1)(图2)(图3)1，图1左侧1为大肠杆菌，左侧2为产气菌，左侧3为对照组。2，图2的左边1是产气细菌(浅橙色)，右边1是大肠杆菌(淡红色)，中间(浅黄色)。图3的左边是大肠杆菌，右边是产气菌。观测结果汇总如下：观察者：丁志康种菌吲哚实验甲基红测试V.p .测试大肠杆菌-煤气生产-对照-(阳性，-阴性)在甲基红测试中，带有气体细菌的试管呈浅橙色，比对照组颜色稍深，但比大肠杆菌浅得多，并被记住为阴性。六、考试问题(1)如何解释淀粉酶是细胞外酶，而不是细胞内酶？(？答：淀粉酶是大分子物质，不能通过transmembrane输送到细胞内，消化淀粉的酶通过细胞分泌进入外部环境，在细胞外水解淀粉后，细胞消化处理的小分子物质必须运输到细胞内利用。(2)不使用碘，如何证明淀粉水解的存在？(？答：淀粉是葡萄糖的多糖体，很可能在淀粉酶水解过程中产生葡萄糖，葡萄糖作为还原糖，像菲林试剂一样检测还原糖，从而确定淀粉酶是否存在。(3)如果哪些微生物可以利用葡萄糖进行有氧代谢，那么通过发酵试验应该得到什么结果呢？(？答：在试管中，培养基将变成黄色，小玻璃管中出现气泡。(4)讨论IMViC测试在医疗检查中的重要性。答：IMViC检查可以非常快速地确认正在测试的细菌的信息，与Berger手册结合初步识别试验菌后，可以与gram染色一起偶尔治疗检验菌，也可以对细菌进行研究，对临床治疗细菌性传染病非常有用。此外，IMViC检查还可以快速确认大肠杆菌和肠杆菌产气过程，这两种菌广泛存在于大自然中，经常作为水源粪便的污染标记，因此也可以广泛用于饮用水检查。七、附加实验中使用的徽章公式1、淀粉培养基蛋白胨10gNaCl 5g牛肉奶油5g可用性淀粉2g琼脂15-20g蒸馏水1000毫升在121 灭菌20min。2、胃蛋白酶水培养基蛋白胨10gNaCl 5g蒸馏水1000毫升PH 7.6在121 灭菌20min。3、葡萄糖蛋白胨水培养基蛋白胨5g葡萄糖5g磷酸二钾2g蒸馏水1000毫升将这些成分溶解在1000毫升水中，调节pH 7.07.2进行过滤。试管，每管10毫升，121灭菌30分钟。4、糖发酵培养基蛋白胨水培养基1000毫升1.6%溴甲酚紫色乙醇溶液12mLPH 7.6糖溶液(葡萄糖和乳糖)的20%提供为10毫升。法律：1、