色谱原理及应用

色谱分析原理及应用,主讲人：郭宾湖南师范大学2013-11-13,化学生物学及中药分析教育部重点实验室流动相间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积;分配系数在各塔板内是常数;纵向扩散可以忽略,（二）热力学理论：塔板理论(PlateTheory),化学生物学及中药分析教育部重点实验室扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差;扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散;扩散系数：Dg(M载气)-1/2；M载气，B值。因此，为了减小B项，可采用较高的载气流速，使用相对分子质量较大的载气（如氮气），控制较低的柱温等。,（2）分子扩散项(纵向扩散项)：,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,（3）传质阻力项C：,（三）动力学理论：速率理论,1.影响H的动力学因素,采用粒度小的填充物和相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可减小Cg，提高柱效；通过减小固定液的液膜厚度df，增大组份在液相中的扩散系数Dl，可以减小CL。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,（三）动力学理论：速率理论(Ratetheory),A：不受u影响B/u：u,HCu：u,H,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,（三）动力学理论：速率理论,2.流动相速率对H的影响,总结果：u较低时：B/u主导，u,H,u较高时：Cu主导，u,H,u最佳,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,（三）动力学理论：速率理论,3.粒径dp对H的影响,如果只关心理论塔板高度（H）与流速（u）及填料颗粒度（dp）之间的关系，就可以把该方程式作如下的简化：,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,（三）动力学理论：速率理论,3.粒径dp对H的影响,1969年，Bidlingmeyer等第一次使用亚2um填料填充的色谱柱进行研究，但因仪器条件等因素的限制，结果重复性较差。1974年，Guiochon等对使用超高压的液相色谱行为进行了理论研究，提出压力对分离的影响规律。1997年，MacNair等使用粒径为1.5um的无孔填料填充了52cm30um的毛细管柱，使用压力达到410MPa，获得的最高柱效为30万块塔板/m。这一实验结果被认为对超高压液相色谱的发展具有里程碑的意义。2003年，Jerkovich等填充了填料粒径为1.0um的色谱柱，最高柱压达到700MPa，等度分离5种组分仅用了8min，分析时间大大缩短。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,色谱法中的两个基本理论,色谱理论需要解决的问题是色谱分离过程的热力学和动力学问题。是要解决影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。,组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论；,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,四、分离效能及其影响因素,（一）分离度或分辨率（R）,相临两色谱峰保留时间之差与峰底宽平均值之比，衡量色谱柱总分离效能的指标。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,（一）分离度或分辨率（R）,R=1.0：tR=4（98%），基本分离；R=1.5：tR=6（99.7%），完全分离；R1.0：完全未分开。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,柱效较高，K(分配系数)较大，完全分离；柱效较高，峰型好，K不是很大，基本上完全分离；柱效较低，峰型展宽，K较大，但分离的不好；柱效较低，峰型展宽，K小，分离效果更差。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,四、分离效能及其影响因素,（二）分离度影响因素,要使R大，必须：1、tR大-k大-【热力学因素】2、W小-峰展宽小-【动力学因素】,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,四、分离效能及其影响因素,（三）色谱分离方程式,分离度受到柱效(N)、选择因子()和容量因子()三个参数的控制。,R=,(-1),4(1+),=N有效,1(-1),4,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,1.分离度与柱效分离度与柱效的平方根成正比，k、一定时，增加柱长，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长；设法降低H最有效。,2.分离度与增大是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相同分离度下，当增加一倍，需要的n有效减小10000倍。增大的最有效方法是选择合适的固定液。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,色谱分析的意义,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,因为保留时间是唯一的定性依据，因此在色谱分析过程中，标准样品是必需的。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,定量分析,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,气相色谱方法及应用,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,气相色谱系统构成,气相色谱仪通常由五部分组成：载气系统：气源、气体净化器、供气控制阀门和仪表。进样系统：进样器、汽化室。分离系统：色谱柱、控温柱箱。检测系统：检测器、检测室。记录系统：放大器、记录仪、色谱工作站。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,电负性,最普适、非破坏,一、常用检测器,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,将流动相中组分的浓度或量信号转变成电信号。,浓度型检测器：测量载气中组分浓度的变化热导检测器、电子捕获检测器等。,质量型检测器：测量组分进入检测器的质量流速变化。火焰离子化检测器、火焰光度检测器等。,或,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,热导检测器（thermalconductivitydetector；TCD）,测定原理：利用组分与载气的热导率之差,优点:结构简单、适用范围广（无机物，有机物），不破坏样品。缺点:灵敏度低，噪音大。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,氢焰离子化检测器（hydrogenflameionizationdetector；FID）,测定原理测定有机物在氢火焰的作用下，化学电离形成的离子流的强度。,优点：灵敏度高，噪音小，死体积小等缺点：破坏样品，一般只能测定含碳化合物。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,二、质谱检测器,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,二、质谱检测器,（一）离子源：离子化技术,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,67,67,（一）离子源：离子化技术,1.电子轰击（EI）：硬电离技术,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,68,68,1.电子轰击（EI）：硬电离技术,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,（一）离子源：离子化技术,2.化学电离（CI）：软电离技术,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,二、质谱检测器,（二）质量分析器（以四级杆为例）,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,气质联用（GC-MS）气质联用是对气相色谱-质谱联用技术的简称，是将气相色谱仪器（GC）与质谱仪（MS）通过适当接口相结合，借助计算机技术，进行联用分析的技术。GC-MS是最成熟的两谱联用技术。,2020/5/27,71,71,三、气相色谱-质谱联用,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,1.GC-MS的接口：由GC出来的样品通过接口进入到质谱仪，接口是色质联用系统的关键。接口作用：压力匹配质谱离子源的真空度在10-3Pa，而GC色谱柱出口压力高达105Pa，接口的作用就是要使两者压力匹配。组分浓缩从GC色谱柱流出的气体中有大量载气，接口的作用是排除载气，使被测物浓缩后进入离子源。常见接口技术有：分子分离器连接（主要用于填充柱）；直接连接法（主要用于毛细管柱）；开口分流连接（放空一部分色谱流出物，让另一部分进入质谱仪。此法样品利用率低。）,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,2020/5/27,73,南京农业大学生命科学学院,气质联用仪,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,74,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,2.,75,难电离（基线低）分子量小（无干扰）,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,3.,三、气相色谱-质谱联用,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,3.,三、气相色谱-质谱联用,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,4.,三、气相色谱-质谱联用,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,5.,三、气相色谱-质谱联用,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,5.GC-MS应用,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,5.GC-MS应用,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,5.GC-MS应用,分析流程：,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,5.GC-MS应用：,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,5.GC-MS应用：,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,5.GC-MS应用：,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,5.GC-MS应用：,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,液相色谱方法及应用,第三部分,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,液相色谱发展历史,经典液相色谱：室温、常压柱效低、时间长（常有几个小时）现代液相色谱：高效液相色谱：HighperformanceLiquidChromatography，HPLC填料颗粒小而均匀高压输送流动相又称高压液相色谱(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,色谱法分析对象,气相色谱：（占目前已知化合物的20-25%）分子量小可挥发低沸点（一般不超过500摄氏度）热稳定性好液相色谱：大多数化合物,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用,HPLCvsGC,气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,一、液相色谱分类,按原理分为：吸附色谱法（AC）分配色谱法（DC）离子交换色谱法(IEC)排阻色谱法(EC)，又称凝胶过滤色谱（GFC）亲和色谱法(AC)分配色谱按固定相和流动相极性分为：反相色谱和正相色谱,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,固定相与流动相,反相HPLC极性:固定相流动相固定相-极性强流动相(己烷,庚烷)-极性弱极性物质后出峰,主流,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,色谱柱分离材料,硅胶表面结构,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,键合固定相制备,ODS(C18)键合相,硅胶,十八烷基氯硅烷,非极性,硅烷化反应,使用pH范围：2-8,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,反相色谱（RP）,C18(ODS)C8(octyl)C4(butyl)苯基TMS氰基,流动相的极性大于固定相的极性,-O-Si(CH3)2-C18H37,非极性,SiO2,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,RP相互作用力是什么?,OH,OH,C18(ODS),强,弱,疏水性,SiO2,作用力强,作用力弱,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,分析条件柱:Shim-packCLC-ODS流动相:MeOH:H2O=7:3流速:1.0mL/min温度:40进样体积:10L检测器:UV-254nm峰1.苯甲酸甲酯2.苯甲酸乙酯3.n-苯甲酸丙酯4.n-苯甲酸丁酯,ODSC8TMS,固定相极性变化对RP分离的影响,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,流动相极性变化对RP分离的影响,20%水30%水40%水,1:对羟基苯甲酸甲酯2:对羟基苯甲酸乙酯3:对羟基苯甲酸丙酯4:对羟基苯甲酸丁酯,有机相:甲醇,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,流动相的选择,在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱。正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,流动相的选择,采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,流动相的选择,水的等级纯化水蒸馏水去离子水,因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,流动相的选择,水中不纯物的出峰,水中的不纯物保留在柱中，随之被乙腈洗脱,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,流动相的选择,有机溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯,都经过蒸馏和0.45m的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒）,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2m的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,流动相的选择,甲醇乙腈正己烷,分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图,溶剂对小于某波长的辐射产生强烈吸收,甲醇210nm乙腈190nm正己烷200nm,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,流动相的选择,截止波长：用1cm光径的吸收池装溶剂，用空气为参比，改变照射波长，当吸光度A=1时，此时的波长称为该溶剂的截止波长（不透明、干扰目标物检测）,一些常用溶剂的紫外截止波长,UV检测时，设置波长不能小于溶剂的最低使用波长（截止波长）。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,流动相的选择,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,流动相的选择,pH2.7,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,正相色谱(NP),硅胶柱:常用氰基柱:常用氨基柱:分析糖二醇基柱:分析蛋白质,硅胶,SiO2,SiO2,-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH),化学键合相,流动相的极性小于固定相的极性,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,相互作用力是什么?,OH,HO,SiOH,SiOH,强,弱,非常弱,氢键力,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,流动相极性变化对NP分离的影响,0%甲醇2%甲醇5%甲醇,1:邻苯二甲酸二辛酯2:邻苯二甲酸二丁酯3:邻苯二甲酸二乙酯4:邻苯二甲酸二甲酯,主要试剂:己烷,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,N+,R,R,R,样品,SO3-,样品,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,离子吸引力,离子交换色谱作用力,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,GPC分离原理,固定相是多孔填料，小分子样品可以进入孔径内部样品与固定相之间无作用力保留时间不同,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,Log(MW),排阻极限,渗透极限,V,GPC分离原理,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,二、液相色谱构成,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,脱气的目的,1.防止由气泡的产生引起的故障2.防止由溶解（在液体中的）气体量的变动引起的检测不稳定程度1）示差折射率检测器*使折射率变化2）UV检测器（200nm以下）*溶解氧气有吸收3）荧光检测器*溶解氧气有消光作用,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,色谱柱,色谱柱的分类：色谱柱按用途可分为分析型和制备型尺寸规格：常规分析柱（常量柱），内径25mm（常用4.6mm，国内有4mm和5mm），柱长1030cm；窄径柱（又称细管径柱、半微柱），内径12mm，柱长1020cm；毛细管柱（又称微柱），内径0.20.5mm半制备柱，内径5mm；实验室制备柱，内径2040mm，柱长1030cm；,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,C18硅胶填料结构,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,柱填料基质,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,三、HPLC检测器,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,紫外检测器的作用原理,紫外检测器(UV),化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,二极管阵列检测器作用原理,二极管阵列检测器(PDA/DAD),化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,荧光检测器(FD),荧光检测器的作用原理,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,示差折光检测器(IRD),原理：通过连续测定色谱柱流出液折射率的变化而对样品浓度进行检测。溶有样品的流动相和流动相本身之间折射率之差反映了样品在流动相中的浓度。公式：R=Zci(ni-n0)R:仪器响应信号；Z：仪器常数；：ci溶质摩尔浓度；ni：溶质折射率；n0：溶剂折射率,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,蒸发光散射检测器(ELSD),原理,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,四、液相色谱-质谱联用方法,液相色谱-质谱联用法的发展,1977年，LC/MS开始投放市场1989年，LC/MS/MS取得成功1991年，APILC/MS用于药物开发,1990年,2000年,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,四、液相色谱-质谱联用方法,LC-MS与GC-MS的区别:,GC-MS是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。LC-MS主要可解决如下几方面的问题：不挥发性、极性、热不稳定、大分子化合物的分析测定。没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,四、液相色谱-质谱联用方法,（一）离子源与接口技术,软电离技术,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,四、液相色谱-质谱联用方法,（一）大气压电离源（以电喷雾ESI为例）,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,四、液相色谱-质谱联用方法,（二）质量分析器（串联四级杆MS/MS为例）,噪音降低、专属性提高；定量范围宽、灵敏准确；多成分同时分析、不需分离,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,四、液相色谱-质谱联用方法,（二）MS/MS质谱扫描模式,全扫描（Q1full）选择离子监测（SIM）子离子扫描（Product）母离子扫描（Precursor）中性丢失扫描（NL）多反应监测（MRM）,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,四、液相色谱-质谱分析方法,（三）LC-MS联用方法,1.LC-MS分析条件的选择和优化,（1）接口的选择（2）正、负离子模式的选择（3）流动相的选择（4）流量和色谱柱的选择（5）质谱参数的优化,2.样品前处理方法,避免、减弱离子化的基质效应,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,四、液相色谱-质谱分析方法,（四）LC-MS应用中注意的几个问题,1.LC-MS系统中常见的本底离子,m/z50-150,溶剂离子，(H2O)nH+，n=3-112m/z102,H+乙腈+乙酸,C4H7NO2H+,102.0549m/z149,管路中邻苯二甲酸酯的酸酐,C8H4O3H+,149.0233m/z288,2mm离心管的产生的特征离子m/z279,管路中邻苯二甲酸二丁酯C16H22O4H+,279.1591m/z316,2mm离心管的产生的特征离子m/z384,瓶的光稳定剂产生的离子m/z391,管路中邻苯二甲酸二辛酯,C24H38O4H+,391.2843m/z413,邻苯二甲酸二辛酯+钠,C24H38O4Na+,413.2668m/z538,乙酸+氧+铁（喷雾管）,Fe3O(O2CCH3)6,537.8793,化学生物学及中药分析教育部重点实验室&岛津合作实验室,四、液相色谱-质谱分析方法,（四）LC-MS应用中注意的几个问题,2.分子量测定中的误判,溶剂中