PCR(生物化学).ppt

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction),根据细胞分裂中DNA半保留复制机理，在体外快速扩增某一特定DNA片段的方法。,PCR工作原理,以要扩增的DNA分子为模板，以一对与模板5末端和3末端互补的寡核甘酸片段为引物4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR特异性取决于引物和模板DNA结合特异性。,体外(试管中)扩增特异DNA片段短时间内即可将所需目的DNA片段扩增至100万倍以上,PCR技术特点敏感度高、特异性强、产率高、重复性好、操作简便、快速,PCR体系基本组成,模板DNA：（102-5）拷贝dNTP底物：20200umol/L特异性引物：0.10.5umol/LDNA聚合酶：KlenowT4、T7聚合酶TaqDNA聚合酶:耐热稳定性、5-3聚合酶活性及3-5外切酶活性，可校正PCR反应中某些单核甘酸的错配。含Mg2+的缓冲液：Mg2+能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为1.52.0mmol/L，过量将增加非特异性条带的产生。,循环次数取决于模板DNA的浓度30次扩增100万倍,反应分三步：,1变性denaturation：加热90-95，模板DNA双链解离形成单链DNA；2退火annealling：温度突然降低,引物与模板DNA结合,40-60,Tm值4（G+C）+2（A+T）-5.3延伸extension：TaqDNA聚合酶以4dNTP为底物，在Mg2+存在的条件下，催化DNA合成。70-75时间-要扩增片段长度决定,1.长度：15-30个核苷酸；2.避免嘌呤、嘧啶堆积，GC：40-60；,引物设计的原则,Tm=69.3+0.41(G+C%),引物长度为18-24个碱基：Tm(C)4(GC)2(AT)5ATGGCGGGCAGGTCAGAAAG3GC12；AT8Tm4X122X864C,3.四种碱基随机分布；4.引物自身不应存在互补序列，以防形成发夹结构；,引物设计的原则,5GTTGACTTGATAT3GAACTCT,5GTTGACTTGATATTCTCAAG3,引物的自身互补序列形成发夹结构,5ACCGGTAGCCACGAATTCGT3,3TGCTTAAGCACCGATGGCCA5,5ACCGGTAGCCACGAATTCGT3,两个引物分子形成二聚体,5.引物之间不应存在互补序列，以防形成二聚体(dimer)；,引物设计软件：Primer3,Oligo,引物设计的原则,6.引物3末端碱基原则上与模板配对，引物的5端可以游离,可添加限制性内切酶识别位点，便于PCR产物的定向克隆。,引物设计的原则,5CATATG,3,3,TTCGAA5,NdeI,HindIII,待扩增片段：1000bp引物Tm55DNA模板变性:94,5分钟;PCR循环(30次):94,30秒;50,30秒;72,1分钟;最终延伸:72,7-10分钟,PCR反应条件的设定,PCR产物的检测,琼脂糖凝胶电泳；（EB）分子杂交；限制性内切酶酶切分析；微孔板夹心杂交法；直接测序,PCR产物的检测-琼脂糖凝胶电泳,PCR产物,PCR产物,PCR技术的应用1.基础研究(1)基因或cDNA克隆：从基因数据库中获得某一基因或cDNA的核苷酸序列，用PCR方法扩增并克隆该基因或cDNA。(2)基因表达：用RT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。2.医学(1)感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核分枝杆菌、乙肝病毒等。(2)遗传病相关基因的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。(3)恶性肿瘤的诊断3.基因动、植物的检测(1)转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。(2)转基因植物的检测：玉米、大豆等。,PCR新技术,RT-PCR：用于RNA分析PCR-SSCP：可用于点突变分析热启动PCR：可提高特异性。不对称PCR（asymmetricPCR）多重PCR(multiplexPCR)巢式PCR(nestedPCR)实时定量PCR(RealTimeQuantitativePCR,qRT-PCR),反转录PCR(RT-PCR)RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。,5,3,AAAAA,5,3,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,RT-PCR原理,mRNA,1stcDNA,逆转录酶、下游引物、dNTPs,TaqDNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs,5,5,3,3,特异PCR产物,5,5,3,3,经30个循环，产生230个分子拷贝,5,5,3,3,一步法RT-PCRRT反应与PCR反应在同一个试管中进行。两步法RT-PCRRT反应与PCR反应在不同的试管中进行。,下游引物特异性引物Oligo(dT),-actinGAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)18SrRNA,用作内参的管家基因,实时荧光定量PCR技术,实现了PCR从定性到定量的飞跃,实时荧光定量PCR原理,指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。特异性更强、有效解决PCR污染、自动化程度高、实时监测反应过程,Ct值的定义,在荧光定量PCR技术中重要概念Ct值C代表Cycle，t代表threshold，Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历循环数,Ct值与起始模板的关系,每个模板Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数标准品作标准曲线，横坐标起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。,荧光定量PCR所使用的荧光化学,荧光染料SYBRGreenI荧光探针TaqMan荧光探针MoleculaeBeaconsScorpionsTM探针Lightcycler,SYBR荧光染料,在PCR反应体系中，SYBRGreenI荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。对引物质量要求较高,TaqMan荧光探针,PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子