宏基因组文库技术与极端环境微生物资源开发利用

1,2007.11.10,宏基因组文库技术与极端环境微生物资源开发利用,申请人：微生物学博士生蒋承建广西大学微生物及植物遗传工程教育部重点实验室,广西亚热带资源保护利用重点实验室,2,应聘目标,应聘方向：极端环境微生物资源及其生理生态和抗性；应聘岗位：项目负责人。,3,教育背景,2002.9-2007.12,考入广西大学攻读微生物学硕士学位，并取得硕博连读资格,将获微生物遗传学博士学位;1997.92001.9,就读于广西大学生物技术专业,获理学学士学位;1994.91997.9,就读于桂林地区高级中学（现在的桂林市十八中学）。广西大学：国家“211工程”重点建设高校，国家教育部、广西壮族自治区省部共建重点高校）,4,科研经历,2000.5-2008.3,广西大学微生物及植物遗传工程教育部重点实验室,广西亚热带资源保护利用重点实验室,主要从事自然界极端环境未培养微生物基因资源的开发利用和工业用酶(蛋白酶、淀粉酶、-葡萄糖苷酶)等酶基因的研究工作;国家“863高新技术计划”(2001AA214141)课题主要执行者;协助导师指导了八名本科生和三名硕士研究生的毕业论文工作,主要涉及各种农药降解菌方面的研究和未培养微生物酶基因资源的利用研究。攻读学位期间，主持实验室财务管理工作，另外全权负责实验室酶制剂和贵重药品的购买保存工作；发表文章、获奖情况等请参考个人简历表。,5,极端环境微生物,极端环境：生命的禁区（相对于人类和其它高等生物所能承受的最大范围而言），诸如：高温(最适生长温度在50以上)、低温(最适生长温度在15以下)、高盐(最适生长盐浓度在0.12M以上)、高碱(最适生长pH大于10)、高酸(最适生长pH低于3)等，另外还有高压、高辐射、高毒性环境等；研究生物进化，生命起源和生物适应机制的理想材料；由于适应极端环境的结果,极端微生物必然具有特殊的代谢类型,并产生特殊的极其多样化的代谢产物,这些代谢类型和代谢产物又完全可以被人类利用；许多天然环境的不合理开发不但使其原貌遭到破坏,而且那里的微生物资源也面临毁灭,因此极端环境微生物资源的研究开发具有紧迫性；极端环境是发现未知微生物资源特别是新型酶类制剂的理想之地。,6,未培养微生物,Itisgenerallyacceptedthatlessthan1%ofbacteriaandfungipresentinmosthabitatshavebeencultivatedforstudyinpureculture.,Thepureculturedbiotechnologyhasmissedupto99%ofexistingmicrobialresources.,HandelsmanJ,MicrobiolMolBiolRev,2004,68(4):669-685.,7,宏基因组文库技术,Metagenomics(alsoreferredtoasenvironmentalandcommunitygenomics)isthegenomicanalysisofmicroorganismsbydirectextractionandcloningofDNAfromanassemblageofmicroorganisms.metagenome-molecularsequencedirectlyclonedfromenvironmentalDNAinvitroevolutiontechnologieswillactsynergisticallytobringamaximumofavailablesequence-spaceintobiocatalyticapplication.Itisthegenomicanalysisofnotonlyunculturedmicroorganismsbutalsothewholeenvironmentalmicroorganisms.,8,宏基因组文库技术应用,MetagenomicsprovidesasecondtieroftechnicalinnovationthatfacilitatesstudyofthephysiologyandecologyofenvironmentalmicroorganismsDiscovernovelgenesandgeneproducts.Discovernovelsmallmoleculeswithantimicrobialactivity.Discovernewmembersoffamiliesofknownproteins.Discoverantibioticresistancedeterminants.,9,发展趋势与现状,一.Genencorcompany成立了专门的宏基因文库开发技术小组；二.宏蛋白质组学技术,MaronPA,RanjardL,MougelC,LemanceauP.Metaproteomics.MicrobEcol.2007,53(3):486-493.,10,碱性污染土壤宏基因组DNA的提取，文库的构建和检测,Vector:pGEM-3zf(+);Library:about30,000clones;Theefficiencyofconstructionlibraryisupto95%.TheaverageforeignDNAfragmentisabout3.5kb,Thelengthofthemetagenomelibrarycovers90MB.,JournalofGuangxiAgric.andBiol.Science,2004,123(11):63-66,11,碱性蛋白酶基因的克隆,Seriesofinterestinggenesencodingproteasewerecloningfromalkalinepullutedsoil.遗传,Hereditas(Bejing)2006，8(10):1287-1293.,12,淀粉酶基因的克隆,Only1interestinggeneencodingnovelamylasewascloningfromalkalinepullutedsoil.,13,-葡萄糖苷酶基因的克隆,Seriesofinterestinggenesencodingnovel-glucosidasewerecloningfromalkalinepollutedsoil.,14,pGXAG309克隆测序验证,NosimilaritywithanyknownDNAgenes.,15,E.Coli系统的过量表达,16,HPLC检测Unbgl1B蛋白催化生成的产物,Conclusions:TheproductofglucosewasdetectedwithHPLCmethodsuccessfully.,17,Unbgl1B蛋白的生化性质,pH:6.08.5;Temperature:42C.,Ca2+;1mM.,18,Unbgl1B蛋白的动力学参数,CloningandIdentificationofaNovel-GlucosidaseEncodedbyaNovelGenefromUnculturedSoilMicroorganisms.PrepareforExtremophiles(IEof2006:2.125).国家技术发明类专利申请：一种编码葡萄糖苷酶的基因（专利申请号：200710143545.8）,19,新型脱羧酶基因的克隆,NosignificantidenticalwithanygeneatDNAlevel;58%identicalwithflavoproteinand56%identiticalwithPhosphopantothenoylcysteinesynthetase/decarboxylase;Namedthisnovelgeneundec1A.,20,E.Coli系统的过量表达和纯化结果,21,LC-MS实验检测Undec1A蛋白的产物,Conclusions:Functionalcharacterizationwithliquidchromatography-massspectrometryconfirmedthattherecombinantUndec1AproteincatalyzeddecarboxylationofL-cysteinetoformcysteamine.,BiochemBiophysResCommun,2007,357（2）:421-426.（IFof2006:2.855）,22,Undec1A蛋白的生化性质,AroundpH7.0,35,Ea=20.66kJ/mol,Sensitivetotemperature,Preferablesubstrate:L-cysteine,1mMMg,23,Undec1A蛋白的动力学参数,国家技术发明类专利申请：一种编码半胱氨酸脱羧酶的基因（专利申请号2006101268431）,BiochemicalCharacterizationofaNovelDecarboxylasefromUnculturedSoilMicroorganisms.InsubmissiontoProcessBiochemistry;(IFof2006:2.008);,24,本工作的主要意义,摸索出了一整套的物理化学酶法处理组合，首次从独特的碱性污染环境体系中提取纯化得到了高质量的宏基因组DNA片断，在此基础上构建了碱性污染土壤宏基因组文库。采用基于功能基因的活性筛选策略我们得到了表达蛋白酶、淀粉酶、-葡萄糖苷酶系列酶基因；采用基于功能基因的直接测序策略我们得到了一个表达L-半胱氨酸脱羧酶的基因。基于氨基酸序列的注释和分析比较和功能鉴定，我们首次将来自于未培养微生物的新型脱羧酶Undec1A蛋白鉴定为HFCD家族蛋白的新成员。,25,目前正在研究的工作,构建下游表达系统，高效稳定的表达目的蛋白；撰写前期工作总结，整理数据，发表相关论文（目前正在投稿一篇，正在撰写一篇）；构建沼气池厌氧环境表达系统和构建沼气池宏基因组文库筛选独特的酶和相关酶基因；（目前的研究进展：成功提取沼气池宏基因组DNA，构建了混合16SrDNA文库分析细菌群的多样性，采用DGGE技术分析不同发酵时期的微生物群落变化。）,26,本人对未来QIBEBT课题研究计划,利用经典的纯培养技术和宏基因组文库技术，系统开发研究极端环境下的微生物基因资源（产甲烷利用菌、甲醇利用菌等甲基营养杆菌）；在可能的基础上构建宏蛋白质组学技术，改进提取酶蛋白的方法，与宏基因组文库技术互补，同时研究功能基因资源；在已经构建的脱羧酶活性筛选策略的基础上，大规