拟南芥原生质体的制备及转化

拟南芥原生质体制备转化操作流程主要试剂1. 纤维素酶解液：试剂15ml酶液体系1 1-1.5 Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225g干粉2 0.2-0.4 Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045g干粉3 0.4M mannitol 1.09g干粉4 20mM KCl 1 ml 0.3 M KCl母液5 20mM MES,pH5.7，1 ml 0.3 M MES,pH5.7母液6 加入10ml 水7 55水浴加热10分钟（钝化酶，提高酶的可溶性），冷却至室温后加入以下试剂8 10mM CaCl，1 ml 0.15M CaCl29 5 mM -Mercaptoethanol（可选用） 1ml 75mM -Mercaptoethanol 母液(Sigma A-6793)100.1 BSA， 1 ml 1.5BSA（4保存）11用0.45m滤膜过滤后使用，酶液是淡棕色的澄清溶液。2. PEG溶液（40%, v/v）（一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100ul PEG4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量）PEG4000 ( Fluka, #81240) 1g.4g水0.75ml.3g 0.8 M Mannitol. 0.625ml2.5ml1 M CaCl2或Ca(NO3)2.0.25ml.1ml约1.2ml 3. W5 溶液（1000ml）154mM NaCl, NaCl 9g125mM CaCl2, CaCl2.H2O 18.4g5mM KCl, KCl 0.37g2mM MES（PH 5.7）， MES 0.39gpH to 5.8 with KOH，高温高压灭菌20分钟，室温保存。4. MMG溶液MaMg溶液（500ml）15mM MgCl2，MgCl 0.71g4 mM MES(PH5.7) MES 0.39g0.4 M mannitol，Mannitol 36.5g用KOH调pH 5.7，高温高压灭菌20分钟，室温保存。5. WI溶液WI(200ml)0.5M mannitol，mannitol 18.217g4mM MES,pH5.7，MES 0.156g20mM KCl，KCl 0.12g高温高压灭菌，室温保存。 实验步骤1. 土培室播种种植拟南芥。2. 生长良好情况下在未开花前用于取材叶片制备原生质体。3. 剪取中部生长良好的叶片用新的剃须刀片切成0.5 -1 mm宽的叶条。4. 将切好叶条掷入预先配置好的酶解液（10ml的酶液用125ml 的三角瓶装）中（每5-10 ml酶解液大约需10-20片叶子（小量）(100 -150 叶片需要40-60ml酶解液（大量）)。并用镊子帮助使叶子完全浸入酶解液。5. 用真空泵于黑暗中抽5-30分钟。6. 或者将叶条至于培养皿中加入酶液放入真空干燥箱里，在黑暗中消化3个小时，此步需要根据你自己的实验经验，通常会延长孵育16-18h。（此时可配制PEG4000溶液，200和1000 ul枪头去尖使操作时吸打缓和。）（此时预冷一定量W5溶液）7. 显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50 um。8. 在过滤除去未溶解的叶片前用等量的W5溶液稀释含有原生质体的酶液。9. 先用W5溶液润湿35-75 um的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。10. 用30毫升的圆底离心管100g，1-2分钟离心沉淀原生质体，如果回收率低可以提高转速或是加入CaCl2（50mM）。尽量去除上清然后用10ml 冰上预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体(电转化用预冷的W1)终浓度为1-2 x 105/ml。11. 在冰上静至原生质体30分钟。(在有些实验中原生质体在使用前可以在室温终保存)以下操作在室温23下进行12. 100g离心1-3分钟使原生质体沉淀在管底。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除W5溶液。然后用适量MMG溶液（1m）重悬原生质体，使之最终浓度在2X105个/ml。13. 加入10 ul DNA（10-20微克约5kb的质粒DNA）至2ml离心管中。14. 加入100 ul原生质体（2x104个），轻柔混合。15. 加入110 ul PEG/Ca溶液，轻柔拍打离心管完全混合（每次大约可以转化6-10个样品）。16. 诱导转化混合物5-15分钟（转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更高转化时间）。17. 室温下用440 ul W5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好以终止转化反应。18. 室温下用台式离心机100g离心1-3分钟然后去除上清，将原生质体轻轻吹打稀释至100ul。再加入1ml W5溶液悬浮清洗一次，100g离心两分钟去上清。