医学真菌生物膜研究进展.ppt

医学真菌生物膜的研究进展biofilms : anewperspectivenfungalinfection，医学真菌学是研究病原真菌和条件病原真菌对人类致病机制、诊断、治疗和预防的重要学科，是交叉、边缘学科。 真菌、酵母、丝状真菌、念珠菌、隐球菌、念珠菌、微丝状真菌(霉菌)、巨丝状真菌(香菇等)、真菌按其菌落形态划分，特征：有多细胞、菌丝和孢子，基本形态为菌丝，特征：在感染组织内寄生或在37高营养培养基培养时为酵母相体外腐生和27培养时菌丝相、皮癣菌、真菌病原形态、真菌毒素中毒症：曲霉毒素、镰刀菌毒素。 过敏性疾病：多形性红斑，外源性过敏性肺泡炎。 浅部真菌病：皮肤及附属器官感染。 深部真菌病：的局限性与系统性。 由于各种原因真菌感染患者增加，美国的流行病学研究显示，从1980年到1982年从1992年到1993年，念珠菌病的发病率从2.6/100万/年上升到72.8/100万/年的隐球菌病从4.0/100万上升到65.5/100万/年北京协和医院1953年至1993年尸检结果显示，后20年深部真菌感染率从1.5%增加到5.6%。 由于这些原因，发生真菌感染的病例大幅增加，很多感染很难恢复。 在相当多的病例中证实了其中与真菌的生物膜形成有关系。 1 .生物膜的形成和结构，生物膜(biofilmfilm )的定义：附着在活着的组织或没有活力的组织表面，其自身产生的被细胞外多基质(extracellularmaxtrix，ECM )包裹的结构的菌细胞群，由ECM和与其粘连的菌细胞构成。 这是另一种微生物对游离状态菌细胞的存在方式。 它能保护菌细胞，显着降低隐球菌等病原真菌对真菌药物的敏感性，甚至降低耐药性。 近年来，发现了包括主要人类病原真菌在内的多种真菌能够形成生物膜。 念珠菌可以形成生物膜，念珠菌形成的生物膜具有对抗宿主防御机制的作用，念珠菌对临床常规抗真菌药物具有明显的耐药性。 Walsh等首先报告了隐球菌生物膜形成的病例，该患者在心室心房旁路术后培养心导管表面生长的微生物膜确定为新生隐球菌，薄膜的超微结构符合生物膜的结构特征，首次证明新生隐球菌也能产生生物膜。 Reynolds发现酿造酵母生物膜的存在。 菌体和支持体表面的附着。 形成微小菌落。 微菌落融合，释放基质形成生物膜底层。 基质大量释放的同时，随着菌丝体和假菌丝体的形成，结构变得复杂起来。 细菌和真菌细胞从生物膜中释放出来，形成新的生物膜，早期，中期，成熟期，生物膜的形成过程，(c )成熟期，白色念珠菌生物膜(生长在聚甲基丙烯酸甲酯上，在荧光显微镜下)，(a )早期，(b )中期，生物膜的结构以白色念珠菌生物膜为例。 前2h :念珠菌细胞主要以芽生孢子形式附着于载体表面。 4h后：开始形成芽管，出现分散的微小菌落，逐渐融合。 中期开始阶段(1214h ) :主要以细胞外基质的出现为特征，细胞外基质与真菌微菌落表面发生碰撞，随着时间的推移增加，直至完全包裹细胞。 成熟期：由胞外基质包裹的孢子、菌丝和假菌丝形成致密网状系统，呈有机三维结构。 白色念珠菌生物膜(生长于假牙树脂表面，共焦点扫描激光镜下):0(a )、8(b )、11(c )、48(d )小时，刻度均为10m，白色念珠菌生物膜(长于玻璃盖，24h，扫描电子显微镜下)注：扫描电子显微镜操作前处理大部分基质被除去， 新生隐球菌生物膜早期：酵母细胞和胞子形成单层结构的中期：逐渐形成菌落的成熟期：产生大量荚膜多糖和胞外物质，使大量酵母细胞形成三维网状结构。早期： a、b出芽，单层生长中期： c、d微菌落形成成熟期： e、f荚膜多糖释放，胞外基质形成和多层酵母细胞包复，c.neformaensb3501生物膜(聚苯乙烯96孔，光镜下生长)，成熟的c.neformaensb3501生物膜(复盖物二、生物膜形成的影响因素，生物膜形成受多种因素的影响：组织类型、血清成分等附着，体外培养也受培养基类型的影响。 如下所示。 血清和组织液成分，血清和组织液的某些成分促进生物膜的形成。 相同材质的载体，体内生物膜的细胞外基质比体外生物膜厚，而且体内生物膜完全成熟所需的时间短。 电容敏感(Quorum-sensing )近年来的研究表明，电容敏感分子在生物膜形成中起着重要作用，生物膜不再是悬浮细胞的简单聚集。 白色念珠菌的容量敏感分子有苯甲醚和羟甲基。 其中苯乙醇与生物膜形成有关，也能抑制念珠菌的菌丝化。 实验证明，白念珠菌处理后的黏附细胞群落可以抑制其生物膜的形成和生长，其作用取决于浓度和法尼科处理时的黏附时间。 在经苯胺醇处理的念珠菌形成的生物膜中，菌丝形成相关基因、细胞壁维持相关基因、细胞表面疏水性相关基因、离子输送相关基因等274个基因的表达发生了变化。 苯甲醇是否通过抑制菌丝化来抑制生物膜的形成还不清楚。 目前，敲除组氨酸激酶基因，仅有少量证据表明被苯妥英抑制的念珠菌能够同时恢复菌丝的生长和生物膜的形成。 细胞表面成分，隐球菌生物膜由多糖基质和分布在其中的酵母细胞组成。 隐球菌生物膜的形成取决于荚膜多糖的释放和对支持物的附着能力。 具有阿尔法放射源的抗荚膜多糖抗体(IgG1)能透过隐球菌生物膜，降低生物膜代谢活性50%，不是特异的单抗。 人外周血单核细胞(pbmcos )、pbmcos的存在促进了白色念珠菌生物膜的形成。 而且，并不像吞噬游离真菌细胞那样吞噬生物膜内的真菌细胞。 只有活化的pbmcos影响生物膜的形成，其作用介于pbmcos释放出的可溶性因子，具体成分尚不清楚。 乙醛还原酶(ADH )、ADH可抑制念珠菌生物膜。 但是，在很多细菌(如金葡萄菌)的生物膜中，ADH的作用恰恰相反。 细菌生物膜中ADH的表达增加，活性增高，产生的乙醇增加。 因此，细菌生物膜有可能通过调节ADH表达来抑制真菌生物膜的形成和发展。 这将成为细菌与真菌的竞争手段。 其他相关基因以念珠菌为例，有很多基因可作用于生物膜的形成和发展。 三、生物膜形成对真菌耐药性的影响，生物膜形成后，真菌对氟康唑、异烟唑、酮康唑、两性霉素b、氟西汀等临床常用抗真菌药物和氯己定等消毒剂的敏感性大幅度下降。 特点：1.耐药浓度超过游离细胞MIC的30-2000倍。 2 .耐药性早期出现在生物膜形成中。 3 .随着生物膜的成熟而增强。 生物膜耐受机制尚不清楚，许多学者认为生物膜耐受是由多种因素决定的。 生物膜细胞的低生长速率被认为是生物膜中细胞生长速率影响药物敏感性的重要调节因素。 事实上，所有抗生素对快速生长的细胞都更有杀伤力。 由于营养获得的限制，生物膜细胞处于缓慢生长的状态，真菌的代谢降低，特别是处于生物膜末端，表明细胞对抗菌药物不敏感。 但这显然无法完全说明生物膜抵抗正常MIC数十倍至一千倍以上浓度的耐药性。 药物渗透率，生物膜确实有延缓药物渗透的作用。但在念珠菌各菌种的生物膜实验中，给药后，生物膜周边的药物浓度达到或超过MIC，不能杀死生物膜细胞。 含有念珠菌和表皮葡萄球菌的混合生物膜，药物渗透更慢。 但是，尽管如此，生物膜边缘的药物浓度还是经常超过MIC。 因此，药物渗透不足不是念珠菌生物膜的主要耐药机制。 流出泵，游离条件下念珠菌抵抗唑类药物的主要机制之一是ABC载体*和主要辅助因子#介导的药物流出泵，cdr1、cdr2和mdr1。 研究表明，生物膜中有两种流出泵基因过量表达。* atpbindingcassettetransporters、CDR基因编码#majorfacilitator、MF、MDR基因编码、流出泵贫乏菌株形成的早期生物膜对氟康唑的敏感性大幅增加。 但生物膜成熟后，药物流产泵菌株耐药不足。 因此，药物流出泵只能在生物膜形成的早期起作用。 在罗丹明(Rh123 )流出检测中分析了流出泵的功能，在早期阶段，生物膜和游离细胞的Rh123保持量有很大的差异，但确认不是后期(12h，48h )。 有学者认为，耐药菌株的存在是生物膜中存在耐药亚群，其生物学特性与普通菌细胞不同，耐药亚群的存在无法完全去除生物膜。 证据表明，早期念珠菌生物膜中的真菌细胞存在两种亚群，它们对氯己定的敏感性不同，菌丝或假菌丝细胞比酵母细胞敏感。 这一现象需要进一步研究和证实。 发现附着面的粗糙度与植入物(钛)上念珠菌生物膜对两性霉素b的耐药性和植入物的表面粗糙度有关。 过于粗糙或过于光滑会降低生物膜的耐药性。 那个机制还不清楚。 MAP激酶mkc1p、有丝分裂原活性蛋白(mitogen-activatedprotein，MAP )激酶mkc1p活性低的念珠菌株能正常产生生物膜，游离细胞对氟康唑的敏感性也不变，但生物膜对氟康唑的敏感性与野生株相比非常高也就是说，MK1只增加生物膜的耐药性，不影响游离细胞。 这是目前已知的唯一生物膜特异性耐药基因。 4 .生物膜抵抗免疫系统的作用，有证据表明新生隐球菌生物膜能有效抵抗巨噬细胞产生的氧化性抗微生物分子。 另外，体外研究表明，念珠菌生物膜中存在的人PBMCs (包括单核细胞和巨噬细胞)不仅不吞噬念珠菌细胞，而且对其生物膜的生长有促进作用。 这些现象表明生物膜抵抗宿主免疫，生物膜的形成可能是隐球菌长期感染的原因之一。 5 .生物膜形成的可行措施是预防生物膜形成，抗荚膜多糖抗体抑制生物膜的体液免疫对抑制荚膜某些微生物膜形成有一定作用的相关疫苗和微生物多糖抗体可用于防止心脏起搏器等植入物的生物膜形成。 已经证明植入物表面粗糙度影响真菌生物膜的耐药性，植入物材料的研究和改进也可能在未来减少真菌生物膜的形成。 已经形成的生物膜用药策略是：1.联用药物无论是抗真菌药物的联用，还是抗真菌药物和抗细菌药物的联用，都可以有效地对抗生物膜的耐药性。 我们对20株新生隐球菌的临床分离株进行过M27-A药敏检查，证明异康唑联合阿奇霉素b的真菌MIC值明显偏低(见表)。 另外，大多数受试者作为协同作用或加法作用没有观察到拮抗作用。 异康唑和阿奇霉素b对20株新生隐球菌MIC值的平均值(g/mL )采用异康唑0.27300.1195阿奇霉素B0.68300.2102联合抗菌药物，大大提高阿奇霉素b的念珠菌生物膜效果，注2、新型抗真菌药物的应用新一代抗真菌药物如棘白抗生素类(卡波芬、米卡芬、安托芬)和两性霉素b脂质体对真菌生物膜有效。链霉抗生物素主要抑制真菌细胞壁1，3- d葡萄糖苷的生物合成。 已经证实了白色念珠菌、新生隐球菌等真菌生物膜具有灭绝的能力。 寻找新的治疗靶点，可以抑制pmt1p的酶活性，阻断生物膜形成的早期阶段，有可能阻止白色念珠菌的定植和生物膜依赖的耐药性。 Pmt酶蛋白作为二聚体存在，结合方式与共同的保守蛋白质区域有关，对Pmt复合体的形成和稳定性是必要的。 该PMT蛋白结合部位为攻击真菌邻甘露糖基化过程提供了靶点。 Mkc1p已被证