血凝与血凝抑制试验标准方法

血凝抑制（血凝抑制（HI）试验操作规程）试验操作规程 1.仪器、设备和试剂的准备仪器、设备和试剂的准备 1.1 仪器及设备仪器及设备 V 型 96 孔血凝板、微量振荡器、低速台式离心机、含 25L 的单道加样器、含 25L 的 八道加样器、小圆底试管、吸管。 1.2 抗原和试剂：抗原和试剂： 1.2.1相应 HI 抗原 1.2.2相应阳性血清 1.2.3生理盐水、阿氏液（血球保护液） 1.2.41%鸡红细胞悬液 1.2.4.1 红细胞的采集从 2-6 月龄 SPF 公鸡翅静脉采集血液与等量的阿氏液混合（采集后 上下颠倒使血液和阿氏液混匀，防止凝血） 1.2.4.2 红细胞的洗涤将于阿氏液混合的血液，分装于圆底试管中，以 1000rpm 离心 5 分 钟，吸弃阿氏液；加入适量生理盐水轻轻吸打将红细胞充分混合，以 1500rpm 离心 5-10 分 钟， 吸弃上清液时， 应注意吸弃红细胞表面的白细胞层， 并应尽量吸净上清液。 按上述步骤， 用生理盐水对红细胞进行洗涤三次，最后一次洗涤应 1500rpm 离心 10 分钟（确保红细胞的 压积） 。 1.2.4.3 吸弃上清液，将沉淀的红细胞吸取 1ml，加入 99ml 生理盐水摇匀配制成 1%的红细 胞悬液。 （按照需要量配制） 1.2.4.41%红细胞悬液的标定 对首次配制的红细胞悬液应进行标定，取配制好的红细胞悬 液 60ml，自然沉降后，弃掉上部生理盐水 50ml，混匀后装入刻度离心管中，1000rpm 离心 5 分钟，红细胞压积应为 0.6ml 2HI 抗原工作液配制抗原工作液配制 2.1HI 抗原血凝价测定抗原血凝价测定 血凝试验： 1 取一块 V 型 96 孔板，按表 1 每孔加入生理盐水 25ul，将 HI 抗原进行系列倍比稀 释，至 11 孔后吸取 25ul 弃去，第 12 孔为对照，稀释后每孔再加入 25ul 生理盐水，最后每 孔加入 1%鸡红细胞悬液 25ul，微量振荡器中速摇匀，置于室温（2025） ，2030 分钟后 判定结果，以能使 100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。 表 1病毒血凝试验 孔号：123456789101112 滴度：1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:512 1:1024 1:2048对照 生理盐水252525252525252525252525 抗原(病毒)2525252525252525252525 弃去 生理盐水252525252525252525252525 红细胞悬液252525252525252525252525 轻轻振荡 1-2min置于 2025静置 20-25min 后判定结果 图图 1 如图 1 所示为禽流感病毒 H9 亚型血凝抑制试验抗原的血凝价测定，第 9 孔为能使 100%红 细胞凝集的抗原最高稀释倍数， 因此该禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原血凝价为1:512 2.2HI 抗原工作液配制及检验抗原工作液配制及检验 2.2.14HA100单位的抗原配制 4 个 100%血凝单位（即 4HA100）抗原的稀释倍数=使 100%红细胞凝集的抗原最高稀 释倍数/4 图 1 所示禽流感病毒 H9 亚型血凝抑制试验抗原的 4HA100单位的抗原 = 512 / 4 = 128 2.2.24HA100单位抗原的检验 4HA100单位抗原的检验按表 2 进行。检查血凝价是否准确，应将配置好的 4HA100单 位的抗原再用生理盐水稀释，使其稀释度为 1:2、1:3、1;4、1:5、1:6、1:7。将每一稀释度的 抗原 25ul 加入生理盐水 25ul，最后加入 1%鸡红细胞悬液 25ul，用微量振荡器中速振匀，置 室温（2025） ，2030 分钟后判定结果。 将血凝板在 2025下放置 2030 分钟后，如果 1:4 稀释度是 100%红细胞凝集终点， 说明配制的是4HA100单位的抗原； 如果100%红细胞凝集终点是1:5或1:6说明配制的4HA100 单位抗原实际上高于 4 个单位；如果 100%红细胞凝集终点是 1:2 或 1:3 说明配制的 4HA100 单位抗原实际上低于 4 个单位。使用时应根据检验结果做适当调整，使抗原工作液确为 4HA100单位 表 14HA100单位抗原的检验 孔号：123456 4HA100抗原的稀释度1:21:31:41:51:61:7 稀释的 4HA100抗原252525252525 生理盐水252525252525 1%鸡红细胞悬液252525252525 轻轻振荡 1-2min置于 2025静置 20-25min 后判定结果 2.2.34HA100单位抗原的调整 稀释倍数=使 100%红细胞凝集终点的稀释倍数 x 原 4HA100单位抗原的稀释倍数/4 图图 2 如图 2 所示，使 100%红细胞凝集终点的稀释倍数为 1:3，说明配制的 4HA100单位抗原实际 上低于 4 个单位， 所以调整后的 4HA100单位抗原稀释倍数 =使 100%红细胞凝集终点的稀释 倍数 x 原 4HA100单位抗原的稀释倍数/4 = 3 X 128 / 4 = 96 按 1:96 稀释禽流感病毒 H9 亚型血凝抑制试验抗原，制成 4HA100单位抗原。 3血凝抑制试验（血凝抑制试验（HI） 3.1取 96 孔微量反应板，分别向 112 孔中加入 25ul 生理盐水。 3.2吸取 25ul 待检血清，加至第一孔内，充分混匀后，吸取 25ul 至第二孔，依次 2 倍稀释 至第十孔，从第十二孔中吸取 25ul 弃去。 3.3每块板上设置标准阳性对照和阴性对照，稀释方法同 3.2 3.4分别向 112 孔中加入含 4HA100单位的抗原 25ul， 微量振荡器中速混匀后室温 （2025 左右）静置 2030 分钟。 3.5每孔中加入 25ul 1%鸡红细胞悬液，微量振荡器上轻轻震荡均匀，室温下（2025） 静置 2030 分钟。 3.6结果判定凝集现象表现为红细胞平铺在 V 型管底壁， 凝集严重时红细胞膜片边缘可 能出现卷边现象。未凝集的红细胞在 V 型血凝孔中呈现为明显的红色圆点。将反应板倾斜 45 度角后判定结果，当红细胞呈现泪滴状流淌且没有凝集颗粒时为 100%抑制。当阴性血清 HI 效价2log2、阳性血清 HI 效价与已知结果相比误差1 log2时，试验方可成立。 以完全抑制 4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度作为 HI 效价。 表 396 孔板微量法血凝抑制试验 孔号：123456789101112 血清稀释倍数1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:512 1:1024 1:2048对照 生理盐水252525252525252525252525 被检血清2525252525252525252525弃去 4HA100抗原252525252525252525252525 轻轻振荡 1-2min置于 2025静置 20-25min 后加入红细胞悬液 红细胞悬液252525252525252525252525 轻轻振荡 1-2min置于 2025静置 20-25min 后判定结果 图图 3 如图 3 所示，抗体 1 完全抑制 4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度为第 10 孔，故其效价 为 1:1024；抗体 2 和抗体 3 完全抑制 4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度为第 9 孔，其 效价为 1:512，阴性血清完全凝集，阳性血清与已知效价一致，因此该结果成立。 附： 阿氏液配方：阿氏液配方： 葡萄糖 2.05 克 柠檬酸钠 0.8 克 柠檬酸 0.055 克 氯化钠 0.42 克 加蒸馏水至 100 毫升，调 PH 值至 6.1，115 度，10 分钟灭菌。4 度保存。使用比例：静