Western Blot常见问题及处理总结

免疫细胞研究western blotWestern Blot常见问题和处理摘要亚目1、western blot的优点答：高灵敏度、ng级、Ecl比色法，理论上是pg级。方便特异性高。为什么我的细胞提取物中没有目标蛋白？答：出于多种原因， a)在你的细胞中，这种蛋白质没有表达，改变一种细胞是；b)细胞内蛋白质分解后，应添加PMSF以抑制蛋白酶活性；(c)你的抗体不能识别目标蛋白，看是否有问题。3、我的细胞提取物中有部分沉淀，有部分清澈，为什么？a)可能会有沉淀物，因为你的蛋白质没有变性，所以适当增加SDS浓度，延长样品的沸腾时间，b)不排除你的抗原浓度太高，添加适量的上等缓冲液也可以。我做的蛋白质分子量很小(10KD)。如何创建WB？答：选择0.2ml的胶片时，可以减少进给时间。你也可以把两个胶卷叠起来移动。只需按其他步骤。我的目的很弱，怎么加强？答：可以增加抗原样品。这是最重要的。也可以减少一项稀释率。电影背景很脏，有什么解决方法吗？答：减少抗原呈献量，降低一项浓度，改变一项孵化时间，提高牛奶浓度。7、目标乐队是空的，周围有背景的原因是什么？答：1抗浓度高，2总是hrp催化活性太强，同时你的显色基质在临界点反应时间不长，催化了周围基质，形成空白，即“反光现象”。减少一项和二项式浓度，或更换新基质。我的胶卷是空白的，怎么了？答：如果能解决以下几个问题，问题大部分在于单星和抗原的制造。A) ii抗HRP活性太强，气质消耗光。B) ECM基质H2O2，不稳定，停用；C) ECL基质未复盖在该位置。D) 2项不活动。我在显影液中冲洗了1，5分钟后，胶片变黑的原因是什么？a)可能是因为红灯的关系，胶卷本来就曝光了，但可以在完全黑暗的状态下工作。看看是否有改善。b)现象时间过长。10、DAB好还是ECM好？答：DAB虽然有毒，但更敏感，是HRP最敏感的气质。ECM结果易于控制，但在催化反应时灵敏度会有所下降，但达到阈值后，能够检测pg级抗原的非常敏感。取决于实验情况。11、抗原检测出的分子量大于数据的情况会怎样？a)抗原形成二聚体。增加巯基乙醇的量，延长沸腾变质时间，就能打开二聚体。b)蛋白质本身的转化：糖基化、磷酸化等12，蛋白质不会转移到膜上，但有胶水，马克转了，为什么？a:可能：a)样品浓度过低。b)传输时间不足.13、准备磷酸化抗体检测样品时一定要添加NaF等吗？答：NaF是广谱磷酸化酶的抑制剂，一般建议添加。但是不需要加，大部分也不需要加。14、为了验证哪些细胞中存在那种蛋白质，需要免疫组织化学检查和西部博客测试吗？做这两个实验的时候，能共享第一项和第二项力吗？答：免疫组织化疗可以用于定位，但不能准确量化，有时有假阳性，不能轻易与背景区分。Western blot可以特定地检测和量化某些蛋白质分子，但无法定位。两个实验的一项有时并不常见。公司的产品说明一般说明可以做什么实验，适用于免疫组织化学时的石蜡切片或冰冻切片等。15、制作韦斯特氏Blot时，蛋白质提取后冷冻保存(非蛋白酶抑制剂)，使用的Blot的第一段，开始有点痕迹，现在越来越差，直到样品120g为止，不能更改为Santa cloz的第一段。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？a:怀疑是样品问题。可能：1，样品不能反复冻融；2、样品非蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一元浓度。在加蛋白酶抑制剂的情况下，一般加入PMSF就可以了，在几个中，再加入几个蛋白酶抑制剂比较好。16、细胞水平要做韦斯特莫司，有多少细胞蛋白质足以制造韦斯特莫司？答：一般510 6就足够了17、同一样品能同时提取RNA和蛋白质吗？会影响Western blot吗？a:是的，没问题。18、同一蛋白质样品能否同时进行两种元素的Western Blot检查？答：当然，有些还可以同时测量数十种样品。19.如果目标蛋白是膜蛋白或细胞质蛋白，那么操作应该注意什么？答：如果是膜蛋白和细胞质蛋白，最好使用洗涤剂，这时添加NaF抑制磷酸化酶活性。20，我样品的蛋白质含量很低，不到1微克。但是，如果你转动胶片，经常会发现只有一部分蛋白质被转移到胶片上。也就是说，在胶片旋转后染色，发现所有有孔的蛋白质带。但是颜色变亮了，怎么解决呢？答：您可以增加样品大小。没问题。还可以通过减少全双工电流来延长时间，增加20%的甲醇。21、想分离的蛋白质分子量为200kd，SDS-page电泳的分离胶浓度有多合适？叠层胶的浓度是多少？这么大分子量的蛋白质容易成为西部部落吗？答：200kd的蛋白质做得不好，分离胶为7%，叠层胶为3.5%。22、如果商量超载，应该用什么方法增加商量？答：可以浓缩样品，也可以根据目标分子量透析一小部分分子蛋白。一般来说，超载30%不是问题。如果已经超过很多，分子量小，可以增加粘合剂的厚度，试验1.5毫米。23、蛋白质变性后能保存多久？答：-80，一两年没有问题。最重要的两件事：不要被蛋白酶水解。不要被细菌消化(被酶水解)。24.蛋白质分子量为105KD，逻辑上以7.5%的比例测定，分离胶和浓缩液都需要11%的配合。a:上面提到的凝胶两种都可以使用。因为105KD的蛋白质在上述两种胶粘剂的线性分辨率内，但必须注意条带位置。25，2抗体是生物素抗体。第3段是亲子生物素系统。采用这种方案后，是调整废液，还是再用5%脱脂奶粉？好像有资料说脱脂奶粉影响亲子生物素的生产？回答：脱脂奶粉不能用。脱脂奶粉中含有生物素，最好换成BSA。26，最后问样品蛋白质的总量是多少，与目标蛋白质的表达量有关吗？答：韦斯特布鲁克通常有30-100微克的标本，其结果与目标蛋白的丰富度、相量、1、2的抗量、孵化时间和颜色持续时间有关。如果开始接触条件，为了得到阳性结果，每个阶段都可以一点一点地计时。当然也有背景。为了取得好的结果，如果抗体好的话更容易，如果抗体不好的话，就需要反复尝试。当然，有些不适合西ern blot。27、创建组织样品的western时如何处理样品？答：粉碎、均匀化、超声波处理是必须的，蛋白质溶解度更好，离心力更强，膜蛋白采用更剧烈的方法提取，低丰度膜蛋白可以分阶段提取(超速离心分离)。还有一点是，组织中蛋白酶活性更强，应注意抑制蛋白酶活性(添加pmsf)。问28，巨大分子量蛋白质200KD，制作western的过程中应该注意什么？答：在制作200kd蛋白质Western Blot时要小心。分离胶最好选择7%。脱粘合剂的时候要注意。转移时间应相应延长。必须参考分子量(否则，如果出现离合器，则不知道如何分析)。29、怎样才能提高上限？a)样品可以浓缩。增加等效值，增加等效值。b)用5倍以上缓冲液稀释变性30，蛋白质的含量有具体要求吗？答：前面的样品要按照实验的要求定，要求定量、半定量的西部blot的情况下，上等量要平均，只是定性程度的情况下，没有太大的关系，尽可能提高，但不能超载。第31，1，2段的比率重要吗？a:调整第一段和第二段力的比例更重要，可以消除非特异性部分。32、要做磷酸化因子Western Blot，那第二次抵抗需要什么？a:第2段不需要。根据实验条件选择。一般建议使用HRP表示的2项力。33、免疫组织化学和韦斯顿博客可以使用相同的抗体吗？答：在免疫组织化学中，抗体识别出非变性抗原决定基(也称为肾上腺素)，有些是线性的，有些是结构型的。线性表位不受蛋白质变性的影响。天然蛋白质和煮蛋白质都含有。结构型表达座受蛋白质空间结构的限制，煮的话变性就会消失。如果在蛋白质中使用几个连续的氨基酸，即识别先声表位置的抗体，那么这种抗体既可以用于免疫集体化，也可以用于威斯特伦，如果抗体识别结构表达者，那么它只能用于免疫集体化。34、Western Blot中的抗体可以重复使用吗？答：抗体工作溶液一般不主张储存的再利用，但如果抗体比较有价值，则可以重复使用2-3次。稀释后2-3天内使用，储存为4度，避免反复冻融。35、Western Blot时PVDF胶片用甲醇浸泡的目的？答：在PVDF膜中使用甲醇泡沫的目的是激活PVDF膜中的正电组，使其易于与有负电的蛋白质结合，在传递小分子蛋白的过程中添加大量甲醇也是其目的。36，检测同一抗体磷酸化和非磷酸化的抗原能在同一膜上吗？答：是的。37、李春红染色的带子，为什么大蛋白质分子一端的突起好像不太好？a:很正常。大分子的蛋白质缓慢移动，如果你增加转移时间和电流，大分子的末端会好很多，但小分子会变轻。38，做Western Blot的时候，可以做同样的抗体免疫组织化学，但不能做Western Blot吗？答：大部分抗体都是抗体的问题，根据抗体的说明，是否能与west ern blot进行免疫组织化学作用。39，如果是68转膜，需要添加多少日作用力？A: 1段说明稀释，如第1段所示，大膜孵化量一般至少为3-5毫升。40，上下槽缓冲的要求，如何获得最佳结果？a:没有特殊要求。但是我们通常在上半身加入新鲜缓冲液，下车可能是重复使用一两次的缓冲液41、运行电泳时，配制的粘合剂为什么总是“收缩”？成分错了吗？a:没问题。水在胶水中蒸发了。用保鲜膜包住整个晚上，在里面加水，保持湿度就可以了；母液(30%聚丙烯酰胺)可能有问题。可替代的试剂尽量改变，选择好的试剂。42.蛋白质的分子量范围很大，所以可以一次分离小21KD、中 66KD、大 170KD吗？a:分布得这么广泛，转移不容易。一般建议：21kd和66kd可以一起转动。12% SDS-page，湿转120毫安，45-60分钟，可根据实验室经验进行调整；170kd的7% SDS-page，200mA 90-120min。43、大分子质量蛋白质不能很好地转移到膜上，转移效率低，如何解决？答：甲醇会降低蛋白质洗脱效率，但提高蛋白质和NC膜的结合能力，防止凝胶变形，甲醇会增加对高分子量蛋白质的迁移时间，因此最好在转移缓冲液中加入20%的甲醇。将转移缓冲液添加到最终浓度0.1%SDS中也是为了提高转移效率。使用高品质传输膜或小直径NC膜(0.2微米)。我戴着视觉标记。但是电泳不能跑8排的原因是什么呢？如何改善呢？胶水用了8%，10%，12%。马克是新买的。答：一般会挂小分子量标记，请尝试增加粘合剂浓度或减少电泳时间。当然，渐变胶也是不错的选择。45、韦斯特Blot实验半定量分析是否需要添加ACTIN内部参数？a:发表文章的实验增加了耐受性，实验严格。46、核内抗原Western Blot内部参数选择是什么？答：组蛋白可选择，在细胞核中组蛋白的表达很稳定，很多部分可以用作内部参数，在线确认后，可以选择所需的内部参数。47、做半限量Western Blot，内部人参-actin，GAPDH哪个好？答：您可以选择beta actin。48、想问细胞分解物选择蛋白酶抑制剂时有什么原理吗？不受组织来源影响吗？细胞膜和细胞质有差异吗？答：一般来说，提取时使用添加了光谱的蛋白酶抑制剂，可以在工作时保持低温。如果没有特别注明使用特殊方法的文献，大体上没有差别。49、全膜后的脱脂奶粉封闭额为5% TBST脱脂奶粉”中TBST最后的那个t是推文，浓度是多少？答：Tween是3360 Tris-buffered saline Tween-20(tbst)，NaCl: 8g，Tris base:2.42g水800毫升溶解，500-100050，关闭，一项，二项式温度有什么规定？例如在室温下还是在4度下？a:都可以在室温下。如果时间不足，一旦孵化，就可以在室温下度过1小时，4夜。51、PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？答：一般来说，硝化纤维素膜通过疏水作用与蛋白质连接，在这种情况下，反复清洗几次，蛋白质容易脱落，结果不好。PVDF膜主要通过该膜的正电荷和蛋白质结合，具有疏水性，但相对较弱。在这种情况下，PVDF胶片和蛋白质连接牢固，不易脱落，结果更好。52