多聚酶链式反应扩增DNA片段.ppt

多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR技术)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。,课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段,A,G,C,T,1、DNA的基本单位脱氧核苷酸,一、DNA分子的结构,鸟嘌呤脱氧核苷酸,胞嘧啶脱氧核苷酸,胸腺嘧啶脱氧核苷酸,2、脱氧核苷酸的种类,腺嘌呤脱氧核苷酸,3、DNA分子的平面结构,氢键,5端,3端,5端,3端,4、DNA的立体结构双螺旋结构,2、时间：,细胞分裂间期（有丝分裂间期，减数第一次分裂的间期）,1、概念：以亲代DNA为模板，根据碱基互补配对合成子代在DNA的过程。,3、场所：主要是细胞核（其次是线粒体、叶绿体）,二细胞内DNA复制的过程,4、条件：,模板：亲代DNA的两条母链原料：游离的四种脱氧核苷酸能量：ATP酶：解旋酶、DNA聚合酶引物：一小段RNA，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,5、过程,（1）解旋：解旋酶、ATP,（2）以DNA的两条母链为模板，根据碱基互补配对规则，合成子链。,（3）子链、母链螺旋构成子代DNA,DNA体内复制（示意）,6、复制特点,半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。,7、DNA复制的方向,DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸,1、PCR的技术（DNA体外复制）的条件,DNA双链,单链,变性（加热80-100）,复性（缓慢冷却）,一、PCR的原理（PCR的技术原理）,一、PCR的原理（PCR的技术原理）,时间（min）,温度,（）,适温延伸,高温变性,低温复性,重复13步30轮,3、DNA复制的方向,DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸,2、步骤：变性复性延伸,PCR技术的原理总结,利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。,体外DNA复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。,复制的方向：子链的5端向3端延伸。,二、PCR的反应过程,变性95oC,5,引物1,5,引物2,5,5,模板DNA,2530次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。,每个循环包括：变性复性延伸,从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。,PCR的反应过程总结,三、PCR反应的实验操作,1、PCR仪,设备及用具,2、微量离心管,一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml,3、微量移液器,用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次,实质上一台能够自动调控温度的仪器,三、PCR反应的实验操作,（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）,四、结果分析与评价,DNA含量的测定：稀释对照调零测定计算（公式见P63）,波长260nm处读数,蒸馏水做对照,50倍,（一）理论上DNA扩增数目的计算,四、课题成果评价,1、一条DNA，复制n次，DNA为2n,2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2n,（二）实验中DNA含量的测定,1、原理,可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关,2、过程,稀释,2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释,对照调零,以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零,取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值,测定并计算,DNA含量（g/mL）50(260nm的读数)稀释倍数,50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1,DNA的含量为50g/ml的,体内DNA复制与PCR的技术区别：,课堂小结,练习巩固,1、关于PCR技术的应用，错误的一项是A古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学CDNA序列测定、基因克隆、刑侦破案D诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定,2、DNA的合成方向总是从子链的哪一端向哪一端延伸？,3、PCR技术最突出的优点是A原理简单B原料易找CTaqDNA聚合酶有耐热性D快速、高效、灵活、易于操作,从子链的5端向3端延伸,4、做PCR使用的微量离心管、