间接免疫荧光法测ANA.ppt

间接免疫荧光法检测抗核抗体（ANA）,制作人：XXX20XX-XX-XX,抗核抗体,【自身抗体】：指抗自身组织、器官、细胞及其成分的抗体【ANA】：指抗细胞核成分（DNA，RNA，蛋白质和酶）的抗体。ANA存在一个谱ANA新概念：抗核酸（Nucleicacid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗体的总称某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内更丰富,ANA检测的意义,有助于疾病的诊断如抗Sm是SLE标记抗体；抗ScL-70是SD的标记抗体；抗Jo-1是PM/DM的标记抗体；观察疾病活动度和治疗反应研究发病机理,【ANA分类】,抗DNA（dsDNA,ssDNA)抗组蛋白（Histone)抗非组蛋白（Nonhistone,ExtractableNuclearAntigen,ENA）抗核仁（Nucleolus）,几种ENA的由来及同义词,Sm：病人名：SmithRNP:u1RNP或nRNPNuclearRibonucleoproteinSSA:ROSjogrenssyndromeASSB:La,Ha,SjogrenssyndromeBJo-1:病人JohnScL-70:Scleroderma,【ANA由来】,中性粒细胞,DNP(DNA-Histone)+抗DNP+补体,均质体,LE细胞,LE细胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等结缔组织病，药物过敏，慢活肝等亦可阳性。抗DNP取代LE细胞的检测,+,ANA的筛选：间接免疫荧光法,ANA的筛选：间接免疫荧光法,实验原理：,生物薄膜载片上的IgA、IgG、IgM类特异性抗体可以与抗核抗原反应；随后，结合抗体可与标记荧光的二抗进行反应，并可在荧光显微镜下观察。,实验原理：,生物薄片马赛克TM技术,【实验步骤】,实验步骤一：准备,检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂，再用水彻底冲洗。需要消毒时，可于3的SekuseptExtra（汉高公司）中浸泡1小时。只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对玻片进行标记。,实验步骤二：样品准备,1:100稀释血清标本。每次实验均需加入阳性和阴性对照。对照血清使用前必须混匀。,实验步骤三：加样,在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。使用聚苯乙烯加样板。加样体积:25l/反应区(5x5mm),实验步骤四：孵育,将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。室温（18-25）温育30分钟。,实验步骤五：冲洗,用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。,实验步骤六：加样,将20l荧光标记的抗人球蛋白（荧光二抗）加入洁净加样板的每个反应区。完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。建议使用连续加样器。加样前应使用加样器混匀。为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。,实验步骤七：孵育,从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。从现在开始，注意避免阳光直射载片。室温温育30分钟。,实验步骤八：冲洗,用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150l)伊文氏蓝进行复染。,实验步骤九：封片,在盖玻片上滴加甘油/PBS。封片体积:10l/反应区(5x5mm)从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。然后再进行下一个载片的操作。,实验步骤十：结果判断,荧光显微镜下观察荧光。,结果判读：,荧光显微镜下观察细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。,【均质型】细胞核呈均匀一致的荧光,【核仁型】核仁部分呈现荧光,【斑点型】(颗粒型)细胞核内呈现斑点状荧光,【胞浆型】,【着丝点型】,混合型：存在两种以上的类型,混合型：存在两种以上的类型,滴度定义：与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察到特异性荧光反应的最高稀释度,【临床意义】,总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一个极为重要的筛选试验。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。ANA阳性者进一步检测各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病情观察、预后及治疗评价有重要意义。未经治疗的、活动性SLE的阳性率为80%100%。药物性狼疮100%、全身硬皮病、混合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等。干燥综合症（SS）、类风关、桥本甲状腺炎等。,活动性SLE（95-100%）非活动性SLE（80-100%）药物诱导的红斑狼疮（100%）混合结缔组织病（1