IPP 分析免疫组化图片PPT课件

。1.图像-普罗普勒斯(IPP)用于分析免疫组织化学图像。2.1.免疫组织化学图像分析的原理是根据染料的颜色深度和分布面积来确定目标蛋白的量。染色面积的分布面积与靶蛋白的量成正比。染色色深与目标蛋白量之间的定量关系符合朗伯-比尔定律，并且是对数关系。3，1.1光密度和灰度混淆不同的概念，光密度：光吸收物质的光密度。最佳密度值与染料物质的量直接相关。灰度：灰度不够黑，是反射亮度的单位。电子照片中像素的亮度称为灰度。嘿。4，灰色：介于白色和黑色之间，示例：1 . the right value on displayscreenisrayvalue . 2 . thedark valueonawhitelisalsograyvalue，255，5，光学密度：吸光物质的光学密度。待测物质的量越高，光密度(光密度值)越高，透射的光越少，在照片中反射的光越暗。外径值与物质的量直接相关。数字图像上点的灰度值与相应物质的光密度值呈对数关系，符合朗伯-比尔定律。理论上，外径值从零到无穷大。在实际应用中，外径值的范围通常为0-2.0或0-3.0。使用外径值是正确的。分光光度计和酶标仪的测量值为外径值。由光密度值传递的显微镜图像上的光强也是由光密度值蛋白质电泳带测得的光密度值。荧光显微镜和荧光分光光度计的测量值为荧光强度。用EB染色的DNA凝胶电泳条带也是荧光强度，但处理方法与光密度相同，因此也使用od值。该OD与以前的OD有不同的含义。这是荧光的光密度。反映荧光物质的数量。当各种图像被拍摄成照片用于数字图像处理时，计算机测量并计算照片的灰度。为了对物质含量进行量化，最终需要将其转换为外径值。因此，免疫组织化学照片的分析结果应该是一个光密度值。它不应该是灰度。确切地说，它是分析免疫组织化学照片的特定染色区域的灰度级来测量组织切片的光密度值。只有标准样品才能用于将外径值与样品数量相关联。外径值是没有单位的相对值。使用酶标仪或分光光度计时，应制作标准曲线。电泳条带的定量分析应使用相同的标准曲线。电泳条带照片的灰度值与样本量之间的关系是一个指数函数。将灰度值转换为外径值时，使用标准点进行定量分析是不准确的。多个标准点的标准曲线也有很大的误差，所以只能说是半定量分析。定量分析指标：综合选项密度和均值密度。图像上每个点的光密度值被累加以获得IOD。该值与目标物质的总量成比例。IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到平均密度，它反映了单位面积目标物质的浓度。当分析和比较样本照片的数字图像时，要比较它们之间的平均光密度值。10，1.3比较两张照片染色物质的质量差异。两张照片的染色深度相同，染色面积大的染色物质量大。11.比较两张照片中染色物质的质量差异。两张照片的染色区域是一样的，染色深度的质量也很大。12.这次你该怎么想？a颜色深，面积小。b颜色浅，面积大。13，比较音量！实际情况非常复杂。阳性样品染色深，阴性样品染色浅。整个图像的IOD的直接比较等于整个图像的平均密度的比较。染色区域的颜色深度相近，染色区域不同。使用不同的面积会得出不同的结论，应根据切片情况进行判断。碘平均20，可能是这个特定的组织区域。21，这个区域是一个特殊的染色区域。当计算IOD时，可以同时计算，但是将此作为平均面积通常是不正确的。22、单个细胞的分析和比较，单个细胞IOD的平均值或单个细胞在单个细胞IOD图像中的平均密度。23、边界不清的贴壁细胞，IOD/全图细胞数(图中细胞数不大，计数也不复杂)。24、分析细胞簇，并在整个图像的黄色区域中测量IOD。然后测量细胞分布面积。染蓝的细胞核数作为细胞数，以碘/(氮)作为统计指标。或IOD/面积。25，2。光密度分析法的技术进步源于图像，简单地测量整个图像的光密度值。在照片中随机选择几个区域，测量它们的光密度值。平均值被计算为整个照片的光密度值。准确选择照片上用染料染色的特定颜色区域，计算这些区域的累积光密度，然后计算统计区域的平均光密度。26，2.1光学密度图像分析仪，用于测量整个照片的光学密度，其原理与分光光度计的原理有些相似，直接测量切片的整体光学密度。很明显，可以根据照片上像素点的亮度来区分测量区域的缺陷。其他颜色的染料再染色也会产生光密度吸收，造成严重干扰。嘿。27，2.2取样测量光密度，在彩色电子图片上选择目标颜色区域，取样测量这些小区域的灰度值，并以平均值作为比较染色深度的指标。随机选择几个区域，但它能是“随机”的吗？imageprop的独特优势。根据颜色标准准确选择AOI(感兴趣区域)。测量该区域的光密度参数。IPP比前两种方法好。当发现文献中使用的图像分析方法是前两种时，可以使用IPP分析和测量来代替。结果更准确。没有必要复制文献中描述的方法。随着计算机技术的发展，将来可能会有更好的图像分析方法和图像分析程序。利用IPP分析免疫组化图像的过程，并对样本进行拍照。在图片上选择一个带有染料色调的区域(AOI，感兴趣区域)。测量这个区域的IOD。选择并测量有效统计区域的面积，以计算光密度平均IOD/面积(平均密度)，从而计算同一实验组切片的每张照片的平均值和标准偏差。用统计学方法分析各实验组的平均密度是否有显著差异。31、3.1用于免疫组织化学半定量分析的照片不同于普通显微镜照片，用于免疫组织化学分析的显微镜照片有特殊的拍照要求。32、显微镜光源，正确调节显微镜光源至白光与太阳光色温。此时，增加一个蓝色滤光片，灯丝电压约为9V。普通显微镜会有说明。这时，镜子下的视野会觉得有点明亮和刺眼。亮度不能通过调节聚光器的孔径来降低，这将影响光学系统的分辨率和图像的清晰度。您不能添加太大的灰度镜来降低亮度。使用25%钕过滤器是可以的。6% ND滤镜经常会导致颜色失真。如果照明光源不是白色且有部分颜色，将直接影响照片的颜色，从而使测量结果不准确。固定显微镜的工作条件不仅是光源的亮度，还包括在更换样品时除了调整载物台位置以外的所有其他部分。特别是，不要在不同放大率的物镜之间来回切换。使用一个物镜拍摄所有照片，然后切换到另一个物镜拍摄照片。为了保证显微镜光源的稳定性和一致性，所有照片应一次拍摄。你不能射几次。最好给显微镜增加一个稳定的电源。这可以保证显微镜光源亮度的稳定性。34，你必须使用一个控制e确保他们的暴露程度一致。35、控制摄像机曝光时间，以控制摄像机曝光时间，使视野中的空白区域呈现纯亮白色。照片中无组织空白区域的背景灰度值应该达到230左右。您可以使用图像分析软件测量空白区域的背景灰度值。背景灰度值低于230容易造成颜色偏差，从而影响图像分析值的偏差。同时，背景灰度值不应太高。将空白灰度值设置在230以上相当于在分光光度计上调整100%透射率。嘿。36、背景的影响，左：黑色和蓝色背景严重影响正面区域的色调。而且降低了黄色像素的IOD值。这将严重影响分析结果。有些电荷耦合器件具有手动校正色温的功能，可以校正背景色调，但暗背景即使不是色偏也会影响分析结果。37、较暗背景值对分析结果的影响，显著性差异，无显著性差异，38、扣除背景后仍无显著差异，注意误差线增加，仍无显著差异，39，不能使用相机的自动白平衡，自动白平衡功能是相机根据照片的整体颜色情况自动对每张照片进行白平衡校正。这将严重影响分析和测量的准确性。显微照片用一种或两种染料染色，照片的颜色应该是不平衡的，不能被纠正。40，最好用专业的CCD来拍照。民用数码相机适合在日常生活中拍照。其自动曝光和自动白平衡功能将有效提高照片的视觉效果。然而，对于显微镜照片，这些功能将改变照片的原始外观，并且它对每张照片使用不同的拍摄条件。照片的分析和测量结果受到严重影响。要关闭这些功能，通常需要非常复杂的设置。不能使用自动白平衡校正，但是有必要在拍摄前使用手动白平衡来校正背景颜色。拍照时，相机应校正背景颜色，使照片中的空白背景为白色。这种比较适用于所有拍摄的照片，与自动白平衡有很大不同。自动白平衡是使每张照片有不同的颜色。41岁。照片应该以无损压缩格式TIFF保存，特别是对于轻度染色的照片，在以jpeg格式保存后，亮度细节将会丢失，导致测量误差增加。注意那些马赛克，42，并总结拍摄注意事项：调整显微镜光源的亮度(电压9伏)，足够白和足够亮。调整相机曝光时间，使背景显示为白色。灰度值优选高于230。验证相机没有使用自动白平衡功能。然而，有必要使用手动白平衡校正功能来将背景颜色校正为纯白色。使用相同的显微镜工作条件和相机工作条件(曝光和白平衡设置)一次拍摄所有照片。以TIFF格式保存照片。相位元素不必太大。Image-proplus是一个用于图像分析和定量测量的软件，它不同于photoshop。IPP的作用不是美化这幅画。如果图片效果不好或者分析结果不理想，应该从切片处理和拍摄过程中找到原因，而不是试图通过修改和处理图片来解决问题。通过IPP进行的分析和测量只能准确地反映图像本身的真实测量数据。IPP IPP的程序界面是典型的windows风格。它包含一些最常用的视窗程序的常用工具。进入IPP后的第一件事就是打开一张图片进行分析。45、46、将分析图片信息保存到数据库中，并将分析图片过程信息保存在程序中是保存原始实验数据的基本原则，这一点必须遵守。将图片信息、图片分析过程和分析信息存储到IPP程序数据库中是保存原始实验数据的操作。应该注意同一张图片上的相同操作。由于一些手动操作不能精确地重复，将有两个ca如前所述，电子照片上像素点的强度由灰度值定义。对于8位数字图像，最亮的白色灰度值为255。最暗的黑色的灰度值为0。这与免疫组织化学染色的光密度值正好相反，因此必须进行校正。将具有大灰度值的白色定义为光密度值=0；定义最小灰度值的黑色光密度值是无限的。为了便于计算，纯黑点的光密度通常设置为2.0或3.0。光密度值与灰度值的换算关系符合朗伯-比尔定律，因此是对数关系。更高的光密度的另一个效果是扣除背景。照片白色背景的灰度值(光密度值)通常小于255，将该值定义为光密度零实际上是背景扣除。理论上，应制作已知数量的标准样品(空白样品、标准样品系列、全黑样品)，以使光密度值更为正值。可以获得更精确的分析结果。在实际操作中，标准样品的制作非常麻烦且难以准确制作。这不太实际。由于影响切片染色过程的因素太多，很难准确控制。因此，最终的分析和测量结果仍然属于半定量分析。50、3.2.3选择测量参数和分析指标。当分析免疫组织化学图像时，通常测量具有特定颜色和累积光密度(IOD)的选定区域的面积与免疫组织化学显微图的比较，并且通常应该分析平均光密度。实时IOD/区域。根据图像的特点，IOD和所选区域的面积应分别测量。应该使用不同的测量指标来比较不同的组织照片。IPP可以测量各种几何尺寸和光密度指数，并可以根据需要选择。在此过程中，还可以设置数据过滤限制，以移除干扰性无效测量数据。选择特定的对象，并且一般免疫组织化学样品中的黄色区域是阳性染色区域。这些黄色(棕黄色)区域的光密度值应在测量过程中进行测量。不测量其他颜色部分。因此，第一个任务是选择这些黄色区域。IPP可以根据图片上像素点的颜色自动选择测试区域。使用分割工具。对于色差较小的图像，也可以使用手动AOI工具来定义要测试的区域。IPP图像分析的中心任务是使用IPP来选择特定颜色的区域。选择特定颜色的区域是IPP最独特的功能。根据特定的颜色特征选择图像中的特定区域，并计算几何尺寸和光密度数据，例如这些区域的面积。分段：适用于选择整个画面中所有具有特定颜色的区域。手动选择测量区域的不规则：工具。54，非常规工具是一个手动工具。a :赛道模式，手动或自动搜索区域边界。55，b:魔棒模式，定义了一个具有特定灰度范围的区域。嘿。56、分割工具：根据颜色标准，选择多个颜色完全相同的区