5 FCM在肿瘤学研究中的应用.ppt

,FCM在肿瘤学研究中的应用,MedlinePublicationscitingFlowcytometry”,0,1000,2000,3000,4000,5000,1960年,1965年,1970年,1975年,1980年,1985年,1990年,1995年,2000年,Year,Publications,Theuseofflowinresearchhasboomedsincethemid-1980s,应用范围,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,肿瘤病理的FCM分析,肿瘤分子生物标志物的FCM分析,细胞增殖和凋亡的FCM分析,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,理论依据,G0期不参与增殖周期循环的一群细胞，即为静止期细胞，其细胞DNA含量为较恒定的2C值,（一）细胞周期,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,理论依据,G1期细胞具有增殖活性，参与细胞周期循环的一群细胞G1期细胞值与G0期细胞DNA值相同，均为二倍体DNA含量,（一）细胞周期,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,理论依据,S期细胞DNA含量值逐渐增加，从2C值4C值直到细胞DNA倍增结束,（一）细胞周期,G2/M期在M期分裂为两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C值，即为四倍体细胞群,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,理论依据,（一）细胞周期,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,理论依据,（二）荧光染料与细胞DNA的关系,荧光染料可与细胞DNA特异性结合，并有一定的量效关系1DNA含量的多少与荧光染料的结合成正比2荧光强度与DNA吸收荧光分子多少成正比,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,理论依据,（二）荧光染料与细胞DNA的关系,3荧光脉冲与组方图的通道值成正比因此，FCMDNA定量分析一个细胞群时，可将二倍DNA含量分布组方图分为三部分，即G0/G1，S，G2/M。G0/G1和G2/M细胞峰DNA的分布均成正态分布。S期可以认为是一个加宽的正态分布,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,G1,Sphase,G2,M,G1,1,21,DNAcontent,TheCellCycle,G0/1,G2/M,S,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,DNA含量的计算方法,1FCM定量分析一个细胞群，其DNA含量值是以DNA指数(DNAindex:DI)表示其相对DNA含量的实验样品细胞G0/1峰的均道值DI=-正常细胞G0/1峰的均道值,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,DNA含量的计算方法,2一个正常的二倍体细胞峰，其G0/G1期细胞DNA含量为2C，DI值为1.0，G2/M期细胞DNA含量为4C，DI值为2.0,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,DNA含量的计算方法,例如如果一个未知DNA含量的细胞群G0/G1期细胞峰的均道值在60道，正常二倍体标准细胞G0/G1峰均道值也在60道，那么，这个未知DNA含量的细胞群DI=1.0。如果一个未知DNA含量的细胞群G0/Gl峰均道值在90道，DI=1.50,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,DNA倍体的判定标准,DNA倍体的判定是根据所测细胞群DNA含量分布组方图G0/G1峰的DNA相对含量值，即DNA指数值进行判定的，从理论上讲，二倍体的DI值应为1.0，四倍体的DI值应为2.0,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,DNA倍体的判定标准,以二倍体参考标准细胞G0/G1期细胞DNA含量定为2C值,DI=1.0，基于标准二倍体细胞的CV值在5%，判定标准即：DNA二倍体2C士2CV值DNA异倍体2C士2CV值,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,DNA倍体的判定标准,即DI1.0士0.1(0.91.10)为二倍体DI1.0士0.15(0.851.15)为近二倍体DI=2.0士2CV(1.902.10)为四倍体DI2.10多倍体其余DI值均为非整倍体在计算DNA异倍体时，把近二倍体，多倍体，四倍体，非整倍体划为异倍体(Heteroploidy)的范畴,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体的组方图类型,自FCM被引入肿瘤研究以来,已经对各类型新鲜肿瘤组织和石蜡包埋肿瘤组织进行DNA倍体的定量分析,为研究肿瘤DNA含量的分布状态,提供了非常直观的参考信息,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体的组方图类型,DNA组方图常见的类型以单一DNA干系多见,说明肿瘤的发生多以单一细胞克隆发生而来。我们对3050例恶性肿瘤DNA倍体分析结果显示,单一DNA干系的组方图占80-90%左右,双干系或多干系的DNA组方图较少见,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体的组方图类型,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体的组方图类型,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体的组方图类型,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体的组方图类型,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体的组方图类型,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体的组方图类型,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体的组方图类型,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,DNA含量检测结果报告,报告中至少应包含以下信息:(1)DNA倍体,包括所有群体的DI(2)主要G1峰的CV(3)S期比例(4)必要的简单评价：如细胞数的不足、碎片较多、CV太高等,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用,膀胱癌肾细胞癌前列腺癌,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用,膀胱癌FCM与膀胱癌的诊断FCM在膀胱癌术后随访的作用FCM在判定膀胱癌的恶性程度中的作用FCM在预测膀胱癌的复发和预后中的作用FCM在指导膀胱癌的治疗中的作用,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用,膀胱癌,膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其癌细胞的分裂增殖能力异常活跃，细胞的DNA含量多有不同程度的增高,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用,膀胱癌标本来源,经膀胱镜或尿管冲洗膀胱脱所获标本含细胞数较多，可提供良好的FCM检测标本，但需受器械检查之苦，尤其在随访中需多次留取标本，病人往往难于接受，所以，唯新鲜尿标本才是真正的非侵入性检查方法,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用,膀胱癌标本来源,应用尿液作FCM检测诊断膀胱癌是否可获得满意结果尚有争议White等曾报告86例膀脱肿瘤患者的尿液和膀脱冲洗液作FCM检测，94%的尿液标本和97%的膀脱冲洗液得到了满意的图形,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用,膀胱癌标本来源,Pritchete等亦采用新鲜尿与膀脱冲洗液标本，发现两者在图形显示及肿瘤检出率方面无明显差异,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用,膀胱癌标本来源,本研究室曾对l01例膀脱肿瘤患者作FCM检测，其中78例取300-500ml新鲜尿液，23例取膀胱镜冲洗液，结果发现肿瘤检出率分别为84.61%和86.95%，两组数据经统计学处理无明显差异,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用,膀胱癌标本来源,所以我们认为，新鲜尿标本适用于做FCM标本，对标本细胞数少，图形不满意者，可取膀脱冲洗液,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用,膀胱癌膀胱冲洗液的收集方法,经膀脱镜或尿导管向膀脱内加压注入生理盐水100-200ml，反复抽吸3-4次，收集的冲洗液应立即放入4冰箱内冷藏，存放时间不应超过24小时。若标本中含红细胞，可采用加蒸馏水的低渗方法去除,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用,膀胱癌膀胱冲洗液的收集方法,将收集到的尿液或膀脱冲洗液离心后，PBS缓冲液冲洗2次，用细尼龙网过滤以去除标本中杂质或细胞团块，离心弃上清液后用70%酒精固定，放10冰箱贮存，最长贮存时间可达6个月,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用,膀胱癌FCM与膀胱癌的诊断FCM在膀胱癌术后随访的作用FCM在判定膀胱癌的恶性程度中的作用FCM在预测膀胱癌的复发和预后中的作用FCM在指导膀胱癌的治疗中的作用,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在泌尿系肿瘤中的应用,膀胱癌（FCM对膀胱癌的诊断）FCMDNA倍体分析诊断膀胱癌的标准：,出现与正常二倍体峰明显分离的异倍体或近二倍体波型高倍体细胞比值15%伴明显四倍体细胞组成的波型G0/l波型变异系数1.5的18例中则有5例死于癌，两组有显著性差异,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（一）宫颈癌（有助于判定子宫颈癌预后）,FCM测定宫颈癌DNA含量显示，在I期子宫颈癌患者中，肿瘤细胞DNA含量与其复发率，生存率密切相关。但临床分期、肿瘤大小、病理分类、淋巴转移与肿瘤细胞的DNA含量无明显相关性,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（一）宫颈癌（有助于判定子宫颈癌预后）,Davis等对56例宫颈癌病人的FCM研究资料显示，异倍体与预后无关。DI大于或小于1.5时治疗失败率均等,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（一）宫颈癌（有助于判定子宫颈癌预后）,由于FCM测定标本来源不同，新鲜活检标本与存档石蜡块不同，仪器基础参数不同，光源不同等因素，所得研究资料不太一致，尚待进一步研究证实,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（一）宫颈癌（二）子宫内膜癌（三）滋养叶细胞肿瘤（四）卵巢肿瘤,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（二）子宫内膜癌子宫内膜癌FCMDNA倍体分析子宫内膜癌DNA倍体与临床分期子宫内膜癌DNA倍体与组织分级,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（二）子宫内膜癌的（DNA倍体分析）,Atkin和Hastin等用FCM分析57例宫内膜癌病人，38例(73%)是二倍体，14例(27%)是非整倍体，DI值在1.65-2.34。8例转移癌中5例(63%)是非整倍体，其中2例伴有腹水，在腹水中的肿瘤细胞DI值和原发癌相一致。据此，他们认为，大多数宫体腺癌为DNA二倍体,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（二）子宫内膜癌的（DNA倍体分析）,Moberger对37例存活8年以上和34例生存期低于2年的宫体癌进行DNA分析，发现2年内死亡的病例中，82%是非整倍体,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（二）子宫内膜癌（DNA倍体分析）,预示：非整倍体病人预后差，生存期短，中等分化和分化良好的肿瘤非整倍体者死亡率高于同级别的DNA二倍体病人,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（二）子宫内膜癌子宫内膜癌FCMDNA倍体分析子宫内膜癌DNA倍体与临床分期子宫内膜癌DNA倍体与组织分级,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（二）子宫内膜癌（DNA倍体与临床分期）,Iversen认为期和期宫体癌中，非整倍体的频率没有显著差异。39个I期病人中8个(12%)是非整倍体，而10例期患者中，5个是非整倍体，这些差异并不大,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（二）子宫内膜癌子宫内膜癌FCMDNA倍体分析子宫内膜癌DNA倍体与临床分期子宫内膜癌DNA倍体与组织分级,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（二）子宫内膜癌（DNA倍体与组织分级）,Iversen报道30例中，级分化腺癌至级分化的腺癌，其DI值从1.1增加到1.47-1.69，差异是显著的。而级和级，级和级之间的差异则不太显著,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（二）子宫内膜癌（DNA倍体与组织分级）,据报道，约1/3的子宫内膜癌具有非整倍体。与卵巢癌、宫颈癌相比发生非整倍体率要低，转移癌的非整倍体发生率高于无转移病例。而非整倍体患者的死亡率明显高于二倍体,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（二）子宫内膜癌（DNA倍体与组织分级）,提示：DNA含量值可做为子宫内膜癌的一项重要指标。这项检查将在子宫内膜癌的预后方面更有意义,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（二）子宫内膜癌（DNA倍体与组织分级）,提示：DNA含量值可做为子宫内膜癌的一项重要指标。这项检查将在子宫内膜癌的预后方面更有意义,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（一）宫颈癌（二）子宫内膜癌（三）滋养叶细胞肿瘤（四）卵巢肿瘤,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤,绒癌和侵蚀性葡萄胎（恶葡）在我国和东南亚一些国家发病率较高。葡萄胎是一种良性病变，文献报道恶变率为10%-20%,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤,绒癌来自葡萄胎者占50%，而恶葡则100%由葡萄胎恶变而来。依据目前的治疗水平，绒癌的死亡率高达20%-30%,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤,在葡萄胎中检出高危病人，及早诊断治疗，则有可能使绒癌和恶葡的治疗时间缩短，减少化疗的次数和副反应，同时可有效提高患者的生存率和生存时间,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤监测葡萄胎DNA倍体与预后,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤（DNA倍体监测葡萄胎）,以往对葡萄胎的监测从几个方面考虑：患者年龄、子宫增大程度、水泡粒的大小以及病理诊断滋养细胞增生程度等，还要根据同位素检测血中绒毛膜促性腺激素（HCG)综合诊断。,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤（DNA倍体监测葡萄胎）,目前，对于高危葡萄胎患者缺乏统一的划分标准，所以对于预防性化疗多不支持。如果有方法能对高危葡萄胎患者及时检出，及时治疗，则具有十分重要的意义,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤（DNA倍体监测葡萄胎）,庄桂霞等对64例葡萄胎(恶性及未恶变者各32例)用FCM测定DNA含量，结果如下表：,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤（DNA倍体监测葡萄胎）,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤（DNA倍体监测葡萄胎）,由表中可以看出未恶变与恶变者非整倍体率分别为34.4%和59.4%，差异有显著意义。若以DNA非整倍体作为一项指标来判断葡萄胎恶变，符合率为59.4%。赵彩彦等检测12例葡萄胎，其中3例非整倍体中2例恶变，符合率为66.7%,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤（DNA倍体监测葡萄胎）,在上组病人中，恶变者32例只有2例病理为滋养细胞重度增生。因此从滋养细胞增生程度来考虑有无恶变可能并不完全可靠,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤（DNA倍体监测葡萄胎）,由此认为，DNA非整倍体预示葡萄胎的恶变倾向，DNA定量分析可以作为其恶变的一项监测指标,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤（DNA倍体监测葡萄胎）,有作者用FCM分析成功38例临床样本，其中绒癌14例、恶葡12例、良葡12例。所有样品DNA直方图均为单蜂分布,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤（DNA倍体监测葡萄胎）,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤（DNA倍体监测葡萄胎）,由表显示，绒癌和恶葡的异倍体发生率无显著差异(P0.05)，二者均明显高于良葡,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤监测葡萄胎DNA倍体与预后,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）滋养叶细胞肿瘤（DNA倍体与预后）,14例绒癌中12例异倍体，平均生存期16%低危组：二倍体，同时SPF9%中危组：其余,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）卵巢肿瘤（非整倍体在交界性肿瘤的诊断价值,卵巢交界性肿瘤的组织学标准难以统一，近年来学者们重点探讨了细胞DNA含量的诊断方法,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）卵巢肿瘤（非整倍体在交界性肿瘤的诊断价值,大量研究资料表明，多数恶性肿瘤都有异常的DNA含量，DNA非整倍体则是恶性肿瘤的一个标志。卵巢的大多数良性肿瘤DNA含量都是二倍体，若出现非整倍体，虽组织学还无恶性特征，但已具备潜在恶性变,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）卵巢肿瘤（非整倍体在交界性肿瘤的诊断价值,Friedlader(1984)分析44例卵巢交界性肿瘤的DNA含量，结果42例(95%)为二倍体肿瘤，仅2例为非整倍体肿瘤，对后者进行复查，均已发现肿瘤侵犯腹膜及网膜的种植瘤结，其中1例患者术后7个月死亡。42例DNA二倍体的交界瘤，经随访313年，均未复发或致死,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）卵巢肿瘤（非整倍体在交界性肿瘤的诊断价值,交界瘤DNA含量呈非整倍体具有恶性肿瘤特征及浸润性生长的特性，故可视为对病理诊断的一个补充，有利于及时制定正确的防治措施,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）卵巢肿瘤（FCM分析与临床应用前景）,Friedlander等对卵巢交界瘤的研究，发现DNA异倍体的交界瘤预后差。其中l例在初诊后7个月内死于肿瘤播散。认为交界瘤出现DNA异倍体，已具有恶性肿瘤的特性,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）卵巢肿瘤（FCM分析与临床应用前景）,对于病理学上难以区分良恶性的卵巢交界性肿瘤，FCM可提示其潜在恶变趋势，有助于对肿瘤的生物学行为作出判断，并有助于患者的治疗及预后预测,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCMDNA倍体检测在妇科肿瘤中的应用,（三）卵巢肿瘤,卵巢癌的DNA倍体和SPF均为客观的重要预后参数，使我们在已有的临床病理基础上，对卵巢癌的恶性度及预后进行更有意义的评价，从而有助于监测病情，制定更合理的治疗方案，直到化疗并评价化疗效果，从而提高卵巢恶性肿瘤的诊疗水平,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCM在脑肿瘤中的应用,FCM已广泛用于脑肿瘤DNA含量的定量研究及其肿瘤标志物的检测，并发现某些肿瘤生物学标志物与预后有关,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCM在脑肿瘤中的应用,有作者对神经母细胞瘤石蜡包埋组织细胞DNA含量进行FCM分析,提示随着临床分期的增高，异倍体出现率有增多的趋向，期异倍体高于、期，异倍体肿瘤组S、G2/M期百分比明显高于二倍体组，随着临床分期的增高，异倍体出现率明显增加,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCM在脑肿瘤中的应用,作者对60例星形细胞瘤DNA含量和S期细胞进行分析：二倍体和近二倍体肿瘤24例，DI=1.100.08，S%=(16.43.6)%，非整倍体肿瘤36例，DI=1.450.28，S%=(21.73.7)%,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCM在脑肿瘤中的应用,二倍体和近二倍体肿瘤DI值S期，细胞与非整倍体肿瘤相比，统计学上有非常显著差异，其组织学分级与DNA含量和S期时相分布有明显相关性，随分级的增高，DI值和S期细胞亦增高,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCM在脑肿瘤中的应用,在有随访结果的46例的肿瘤中，DNA指数分别为DI1.30的24例，平均生存期为36.211.2月，两组生存期有显著差异，22例生存期长的病人，S期细胞百分比为16.43.7%，24例生存期短的病人，S期细胞百分比为18.2士4.6%,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCM在脑肿瘤中的应用,提示：肿瘤细胞DNA含量和S%与恶性程度、组织学分级有密切关系，随着组织学分级的增高，DI值和标志着肿瘤增殖活性的S期细胞亦增高,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCM在脑肿瘤中的应用,有人对46例脑星形细胞瘤癌基因rasp21蛋臼产物表达和DNA含量进行流式定量分析，试图揭示二者之间的关系及其对预后的意义,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCM在脑肿瘤中的应用,结果表明，脑星形细胞瘤的DI值和P21FI值及DNA异倍体的出现率分别随组织学分级的升高而升高。P21阳性率和异倍体出现率分别为50%和71.74%。DNA异倍体肿瘤P21阳性表达率明显高于DNA二倍体肿瘤的P21阳性表达率(分别为19.1%和20.9%),实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,FCM在脑肿瘤中的应用,肿瘤细胞分化程度与P21表达密切相关。分化I级、级、级、级星形细胞瘤，P21阳性表达率分别为13.04%、17.4%、56.52%、63.04%提示随组织学分级的增高，P21阳性表达率也增高，随访资料亦提示DI值高和P21表达阳性患者愈后差，生存期短,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（一）何杰金氏淋巴瘤（二）非何杰金氏淋巴瘤,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（一）何杰金氏淋巴瘤,Brdkamp等以多参数FCM分析方法对137例Hodgkins淋巴瘤的DNA异倍体进行了研究，137个病例中有67例(49%)可见DNA异倍体。DNA指数0.69-1.89不等，其中24例为亚二倍体。在多数病例中异倍体细胞核的数目超过RS细胞和Hodgkin细胞在肿瘤中所占的比例,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（一）何杰金氏淋巴瘤,提示：Hodgkins淋巴瘤中的恶性细胞并不仅仅限于传统上所认为的RS/H细胞,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（一）何杰金氏淋巴瘤,作者进一步以ICM方法和FCM方法对比研究发现Hodgkins淋巴瘤中DNA异倍体细胞在形态学上多为RS/H细胞或中等大小的具有淋巴细胞形态的细胞,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（一）何杰金氏淋巴瘤,细胞分选发现，DNA含量4-8倍于正常DNA含量的细胞核多类似于典型的RS细胞核，而近二倍体或近三倍体细胞核所相应的细胞在组织学切片上尚难以确认为其是肿瘤细胞,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（一）何杰金氏淋巴瘤（二）非何杰金氏淋巴瘤,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,从80年代后期以来，NHL细胞DNA含量FCM分析的研究很多。早期多以石蜡包埋或新鲜切除的肿瘤组织进行分析，近年来使用针吸活检材料，亦取得了较满意的效果,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,NHL细胞FCMDNA异倍体的检出率19%到76%不等，多数学者认为与分型及预后无关，但亦有学者认为与治疗反应有一定关系。而SPF则是NHLFCMDNA分析中最有意义的参数，SPF的高低与肿瘤分型、病人存活时间的长短密切相关,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,1987年Wain等对106例NHL的免疫表型和DNA含量进行了对比研究，结果表明，B细胞NHLDNA异倍体与表型无关，但其DNA异倍体率较T细胞NHL高。T细胞NHL和B细胞NHL的SPF无差异,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,Young对111例NHL的分析显示，异倍体的出现率与病人年龄、肿瘤分期及存活时间无关。56例二倍体NHL的SPF值低于10%者预后较好,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,Christensson等通过对234例未经治疗的NHL病人的活检材料进行FCMDNA分析发现：高度恶性NHL的SPF明显高于低度组。组织学分化程度高、SPF低(5.6%)的病人获得完全缓解(CR)的机率较SPF高者高,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,在低度恶性NHL组中，DNA异倍体者对治疗反应差、CR时间短，但S期值与治疗反应无关。SPF与淋巴细胞型和滤泡中心细胞型NHL病人的存活有关，但与淋巴母细胞型者无关,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,左连富等分析了32例NHL的DNA含量，发现NHL的DNA非整倍体率为53.2%，显著低于其他恶性实体肿瘤，非整倍体的出现率随NHL的恶性度的增高而增加。NHL细胞SPF随NHL的恶性度的增高而增高,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,吴焕明分析了FCMDNA检测在判断NHL预后方面的意义，发现47%NHL病例可见DNA异倍体。其中，中高度恶性者异倍体出现率分别为51.9%和76.8%，明显高于低度恶性的17.6%，SPF随肿瘤恶性程度的增高而增高，DNA倍体状态与存活率无关，但SPF与存活率密切相关,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,Macartney对83例滤泡性NHL进行了FCMDNA分析，发现DNA异倍体罕见，且与存活时间和向高度恶性转化无关。肿瘤SPF增高者病人存活时间缩短而且肿瘤在复发时向更恶性转化的危险增加。多因素分析结果表明SPF5%是滤泡性NHL决定存活时间最重要的因素之一,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,值得注意的是NHLFCMDNA含量异质性问题，Cowan等对197例高、中度恶性NHLDNA含量和其预后意义及与临床病理的关系分析发现，16%肿瘤内不同部位细胞的DNA倍体存在明显差异，肿瘤内PI的变异在5%左右,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,Young等在48例DNA异倍体NHL中，也发现有3例为多异倍体类型。因此，在进行NHL的FCMDNA含量分析时，应考虑取材的广泛性和代表性，以期使FCM检测结果能充分反应NHL细胞DNA含量的全貌,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,Joensun等以FCM方法研究了37例NHL的生物进展情况，所有病例均在诊断后5个月到15个月重复活检，在随访过程中，11例低度恶性肿瘤中有4例(36%)转化为中度恶性，16例中度恶性者有4例转化为高度恶性(25%)，上述8例发生转化的淋巴瘤中有5例在复发后18个月内死亡,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,不管是最初诊断，还是首次或末次重复活检，SPF均与预后密切相关，若重复活检SPF值比首次SPF值高6%或以上，则预后差,实体肿瘤DNA倍体的FCM分析,恶性淋巴瘤FCMDNA倍体分析,（二）非何杰金氏淋巴瘤,该研究表明在恶性淋巴瘤的发展过程中，不但低度恶性淋巴瘤可转化为较高度恶性者，而且需高度恶性者可转化为更恶性的形式，SPF在监视NHL的生物学行为方面具有应用价值，可提供一些单靠组织学研究所不能获取的信息,十、流式细胞术在软组织肿瘤的应用单细胞悬液制备方法1.新鲜组织新鲜肉瘤组织分别以机械方法和酶消化方法进行细胞分散，检测发现机械法制备的样品检测CV(CoefficietofVariation)值较酶学法低，但获取细胞的数量和活性均不及酶学法。在各种消化酶中，胃蛋白酶、膜酶和透明质酸酶均无分散作用，只有胶原酶或胶原酶和透明质酸酶合用可取得良好的分散效果。胶原酶的使用浓度为5mg/ml，若将其提高至10mg/ml，获取细胞数量亦随之增高，但细胞活性下降，CV值增大。,2.石蜡包埋组织：多数工作采用Hediey的方法，但由于肉瘤本身的特点，以石蜡包埋肉瘤组织进行FCMDNA检测，常出现较多的人工假象及错误，限制了其临床应用。研究发现，与新鲜组织明显不同，胶原酶对石蜡包埋肉瘤组织消化作用甚差，而膜酶和脯蛋白酶提取均优于胃蛋白酶，可使悬液中肿瘤细胞数增多，DNA检测结果与新鲜组织更接近。使用上述优化方法对50例软组织肉瘤进行了石蜡包埋组织与新鲜组织对比FCM研究，发现石蜡包埋组织DNA检测结果的错误率仍高于新鲜组织。,几种常见软组织肿瘤FCMDNA分析横纹肌肉瘤：对70例石蜡包埋横纹肌肉瘤进行FCMDNA检测，发现其中23例显示DNA二倍体、32例异倍体、8例多倍体、7例四倍体。与其他肿瘤明显不同，异倍体横纹肌肉瘤预后最好，四倍体居中，二倍体及多倍体者预后最差。多因素分析结果表明，DNA倍体是与TNM分期和发生部位及组织学分级同样重要的独立预后判断因素。细胞增殖状态对横纹肌肉瘤的预后也有影响，S期细胞比率高于15%的32例中，仅10例长期存活，而低于15%的29例中有20例长期存活。,2.纤维组织来源肿瘤：结节性筋膜炎、纤维瘤病和纤维肉瘤均系纤维组织的瘤样病变或肿瘤。对9例结节性筋膜炎、20例纤维瘤病和19例纤维肉瘤的石蜡包埋组织进行FCMDNA倍体及增殖指数(ProliferationIndex,PI)分析结果表明，全部结节性筋膜炎和纤维瘤病均呈DNA二倍体，而19例纤维肉瘤中有5例出现DNA异倍体。纤维肉瘤的PI(28.1%)明显高于结节性筋膜炎(15.8%)和纤维瘤病(16.8-17.8%)(P14%。因此，认为异倍体出现及高增殖活性是骨肿瘤恶性的特征。Look等通过对临床诊断时未发现有肿瘤转移的26例骨肉瘤进行FCMDNA检测，发现25/26病例均可检出超二倍体干系，但其中15例可见近二倍体干系与之同时存在。经三年随访，具有近二倍体干系的15例中仅2例发生肺转移，而无近二倍体干系仅有超二倍体干系的骨肉瘤70%(7/10)发生肺转移。因此认为，近二倍体干系的存在与骨肉瘤临床经过良好有关。,应明等对18例骨肉瘤及其他骨肿瘤的研究结果则表明，该组骨肉瘤病例均为DNA异倍体，且有4例出现DNA双干系。认为异常DNA含量是肿瘤恶性的标志，而DNA双干系的出现则是肿瘤高度恶性的特征。最近，VanOvan报道一病例初诊时经病理学及FCM分析为典型骨旁骨肉瘤，但切除后8个月,部分肿瘤显示高度恶性特征，FCMDNA分析也发现DNA异倍体。原发瘤切除后1年肺转移。进一步肯定了FCMDNA检测在骨肉瘤生物学行为判断方面的应用价值。Mankin认为，通过一些技术上的改进，FCM在评估骨肉瘤病人预后和评价治疗效果方面具有一定价值。,Ewings肉瘤Ewing氏肉瘤是儿童期最常见的骨肿瘤之一，恶性程度高，5年生存率只有40%。临床上须与横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤及淋巴肉瘤鉴别。FCM分析表明，多数横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤为DNA异倍体而Ewing氏肉瘤则多为二倍体。Kowal-Vern等以FCM和ICM方法探讨了Ewing氏肉瘤和骨外Ewing氏肉瘤DNA含量、形态学特征、发生部位和生存时间的关系，FCM检测的18例中，12例为二倍体、1例为异倍体、4例为四倍体，另l例不成功，ICM也得出了相似的结果，FCM和ICM两种方法的符合率为75%。作者认为Ewing氏肉瘤的DNA倍体与形态学特征、发生部位和生存时间均无关系。,Diedok对37例Ewing氏肉瘤组织切片进行原位细胞光度测量，26例以Hedley方法进行FCM检测，DNA异倍体肿瘤病人均在最初诊断后5年内死亡，19例正常DNA分布的肿瘤病人中的11例(58%)仍健康生存，平均存活时间是7.5年。在FCM检测显示为正常DNA范围的15例病人中有8例健康生存，平均存活时间8年，因此认为，Ewing氏肉瘤的DNA异倍体与预后有关。此外，ICM和FCM两种方法均是判定Ewing氏肉瘤预后的可靠方法。两种方法相比，细胞光度测量术对判定病人预后方面优于FCM方法。,骨巨细胞瘤骨巨细胞瘤具有局部呈侵袭性生长特征，但由于临床病程变异大，治疗方案的确定往往存在一定困难。Helm对28例骨巨细胞瘤进行了FCMDNA分析，探讨了FCM方法对其诊治的价值。结果发现，治疗类型与骨巨细胞瘤的预后有关，FCMDNA结果无助于骨巨细胞瘤生物学行为的判断。相反，尹格平等对35例骨巨细胞瘤的FCM分析结果显示，所有I级和29.4%的级骨巨细胞瘤为DNA正常倍体，而70.6%级和所有级骨巨细胞瘤为DNA异倍体，认为FCMDNA含量能客观反映肿瘤生物学行为，提示临床预后。,不论病理分级如何，良性和低度恶性骨巨细胞瘤为2倍或近二倍体，中度恶性为低异倍体，高度恶性为多倍体或双DNA干系。与病理分级相比FCM可提供肿瘤生物学行为、预后等方面的重要信息。国内另一作者通过对44例骨巨细胞瘤的FCM分析，发现2例级骨巨细胞瘤均显示DNA异倍体，且1例发生肺转移，而42例和级骨巨细胞瘤中16例为DNA异倍体，细胞增殖活性与DNA异倍体率在和级间无明显差别，但在原发与复发肿瘤间差异显著。因而亦认为，FCMDNA分析有助于常规组织学分型与分级的确定，并可为临床提供预后有关的信息。,软骨肉瘤应明等对11例软骨肉瘤的研究结果亦表明，除1例为二倍体外，其余10例均表现为DNA异倍体，旦多数为低异倍体，因而提出，异常DNA含量是肿瘤恶性的标志，而DNA双干系的出现则是肿瘤高度恶性的特征。国外有学者分别报道了罕见的透明细胞和印戒细胞软骨肉瘤，其FCM分析结果均为DNA异倍体。,elNaggar等学者进行了骨肿瘤FCMDNA/RNA的研究工作。DNA/RNA的FCM定量分析结果表明，与多数DNA研究结果相似，DNA倍体、增殖活性在良恶性骨肿瘤间差别显著，良性肿瘤主要表现为DNA二倍体、低增殖活性，而多数恶性肿瘤则表现为DNA异倍体、高增殖活性。RNA分析结果表明，骨巨细胞瘤、动脉瘤型骨囊肿、软骨母细胞瘤细胞RNA含量高，这有助于此类肿瘤的鉴别诊断。此外，作者还发现，低度恶性肿瘤的增殖活性与临床预后有关。术前治疗明显影响肿瘤增殖活性。可见FCMDNA/RNA分析有助于某些骨肿瘤的鉴别诊断，有助于治疗反应的评价并有助于骨肉瘤生物学行为的判断。,十二流式细胞术在皮肤肿瘤中的应用皮肤肿瘤的应用FCM用于皮肤肿瘤方面，首先用于区分良性肿瘤与恶性肿瘤。如日光性角化病、鲍温样丘彦病、脂溢性角化与皮肤鲍温氏病、鳞状细胞癌及基底细胞癌,色素德与黑色素瘤。皮肤淋巴细胞浸润、皮肤反应性淋巴细胞增生与草样肉芽肿、Sezary综合征。皮肤纤维瘤与纤维肉瘤。良性肿瘤的DNA含量低，恶性肿瘤的DNA含量高。良性肿瘤几乎均为二倍体，恶性肿瘤大多数为异倍体。Barlogic研究5000多例人体肿瘤，发现各种恶性肿瘤的异倍体率为67%-90%。,恶性黑色素瘤与色素痣：恶性黑色素瘤(Malignantmelonamh，MM)是恶性程度非常高的肿瘤，病情进展快，经过各种治疗后，肿瘤仍易复发和转移，生存率低，预后极差。Hulkrt从曾经研究的71例MM中，选择资料完整并已随访4-10年的63例MM用于FCM的研究，结果发现28例(44.4%)为异倍体,4例为四倍体,四倍体肿瘤经治疗后全部复发。将MMDNA倍体与浸润垂直厚度，复发率等进行多参数相关与回归分析发现，肿瘤异倍体和浸润垂直厚度一样，它们与肿瘤的复发显著相关，可作为预测MM复发的一项独立的指标。,近来报道用FCM检测DNA含量已阐明了肿瘤的内在遗传变异，并提示期恶黑DNA异倍体患者的生存率较DNA二倍体患者的生存率低，期MM预后的差异较大，这种差异与核异常有关。Qing等探讨FCM参数与肿瘤预后的关系，测定了22例期的MM的DNA含量，结果发现19例(86%)为异倍体，3例为四倍体，所有病例均发生转移。用细胞克隆分析发现7例为单克隆，15例为多克隆，7例单克隆患者的生存时间超过14个月，15例多克隆患者中有8例(53%)患者的生存时间少于14个月，单克隆肿瘤患者的生存率显著高于多克隆患者。,在FCM检测DNA变异系数与临床关系方面发现:DNA变异系数低于30%的MM患者的生存时间均超过14个月，15例变异系数超过30%的MM患者中8例(53%)的生存时间少于14个月、7例(47%)的生存时间超过14个月,同时发现DNA变异系数超过30%的肿瘤常为多克隆。我们曾报道一组MM有异倍体为86%，虽然不同作者选择的病例有差异但绝大多数报道MM的异倍体率为70-90%。通过上述分析认为异倍体为恶性肿瘤的一个独立而可信的指标，它与肿瘤的复发和生存显著相关，二倍体MM的5年生存率为76%，异倍体MM的5年生存率为23%。至于DNA异倍体产生的机制，目前仍不十分清楚，但多认为是染色体的丢失或不分离，其中一个重要环节是肿瘤细胞的多倍体化(Polypioidazation)。,色素痣为皮肤的一种良性肿物，可分为先天性色素痣和后天获得性色素痣，色素痣与MM有某种程度上的相关联，可以演变为MM，尤其先天性色素痣已被认为是MM的潜在病变。Peter研究36例先天性色素痣和16例后天性色素痣，发现4例先天性色素痞的S期百分率明显增加，其中2例DNA含量异常，表现为异倍体，后来证实异倍体先天性色素痣恶变MM，其余先天性色素痣和后天性色素痞均为二倍体，后天性色素痞的S期百分率无明显增加。,2.皮肤鳞状细胞癌与鲍温氏病及日光性角化病:日光性角化、鲍温病与皮肤鳞状细胞癌是一组相关的疾病。已有作者用FCM检测这三种疾病的DNA含量和细胞增殖动力学来观察证实这三种疾病的演变。肿瘤DNA含量、倍体和细胞增殖动力学的变化不仅可鉴别良、恶性肿瘤，还可以用这些FCM参数对同一种肿瘤进行分级、并判断分化程度。分化好的鳞癌(I级)与分化差的鳞癌(-级)其DNA含量不同，细胞增殖动力学也不相同，前者DNA含量低、无异倍体。后者DNA含量高，常有DNA异倍体和S期百分率增加，原发鳞癌与复发鳞癌的DNA含量也不尽一致。,John报道大约70%未治疗的鳞癌有DNA异倍体，同一作者研究72例复发鳞癌发现大多数复发鳞癌为DNA二倍体，平均DNA含量、DNA异倍体和相关的S期百分率降低，对比研究原发的鳞癌的FCM参数提示鳞癌DNA异倍体对各种治疗是敏感的，二倍体肿瘤对细胞毒性等化疗药物的敏感性低，这与二倍体肿瘤DNA合成少有关。因此，FCM检测肿瘤细胞DNA含量，有助于推测肿瘤的临床化疗效果。有助于研究肿瘤的生物学反应及肿瘤对化疗药物所产生的耐受机制。因此检测肿瘤的FCM参数，可推知肿瘤的生物学行为。目前已有检测鳞癌等表皮肿瘤的癌基因和表达产物的报道，这可为肿瘤的基因治疗打下基础。,3.菌样肉芽肿和Sezary综合征:皮肤菌样肉芽和Sezary综合征的DNA含量高，DNA异倍体率为70%，这DNA异倍体肿瘤经过综合治疗后易早期复发，临床预后差，而二倍体菌样肉芽肿的临床经过相对良好，患者生存时期显著长于异倍体菌样肉芽肿。因此检测这二种肿瘤的DNA含量有助于评价临床生物学行为，同时也有助于与皮肤淋巴细胞浸润与反应性淋巴细胞增生相鉴别。,在性病防治中的应用我们曾报道用FCM检测12例尖锐湿疣病变组织DNA含量，发现尖锐湿疣的DNA含量为二倍体，但S期比率(SPF)和增殖指数明显高于传染性软疣,，其中2例尖锐湿疣组方图中S期增高，出现明显的G2M峰，其组方图与恶性肿瘤的组方图十分相似。从这些检测结果可推知尖锐湿疵生长迅速，极易复发，有恶变潜能，这已有了细胞生物学依据。,因此用FCM检测尖锐湿疣病变组织的DNA含量和细胞周期分布，可以动态观察病变发展过程，监测其恶变，可能有助于癌变做出早于组织病理诊断。试想如筛选疣组织、疣周围组织及远处正常皮肤，检测DNA量和细胞增殖情况可以确定激光切除范围，减少复发。,在真菌及其有关皮肤病的应用用FCM研究真菌国内外有少数报道，用FCM检测真菌的DNA含量，可以确定真菌的种属，日本作者用FCM成功地鉴别了皮炎外瓶霉，从梗孢外瓶和甄氏外瓶霉，从而对真菌进行分类、分型，这些用于真菌性皮肤病的研究，可以确定疾病的病原体，并可对真菌性皮肤病进行分类、分型，同时还可以发现一些新的真菌群和相应的病种。,Dvorak等检测了5株念珠菌的DNA细胞周期，其结果表明:对数生长阶段的念珠菌细胞绝大多数处于G2M期，稳定生长阶段的细胞绝大多数处于G0/G1期，且稳定生长阶段的DNA总含量有明显的种间和种内差异，即热带念球菌和近平滑念球菌的DNA总含量高于白念球菌的DNA总含量。国内有作者检测了7种8株念球菌的DNA总含量，其中3珠白念珠菌和l珠近平滑念珠菌的DNA含量均高于热带念珠菌，3株白念珠菌中仅有1株的DNA含量低于近平滑念珠菌。上述两作者的结果一致，各种念珠菌稳定生长阶