丙种球蛋白的制备PPT课件

.,1,丙种球蛋白的电泳制备预习方案,组别：第二组成员：张婉月臧赢徐洁严梦迎陈孝颜,指导老师：韦平和彭佳平,.,2,丙种球蛋白概念,中文简称：“丙球”英文名称：-globulin、gammaglobulin别名：免疫血清球蛋白，普通免疫球蛋白，人血丙种球蛋白，丙种球蛋白，静脉注射用人免疫球蛋白（pH4）丙种球蛋白预防传染性肝炎，预防麻疹等病毒性疾病感染，治疗先天性丙种球蛋白缺乏症，与抗生素合并使用，可提高对某些严重细菌性和病毒性疾病感染的疗效。注：由于人血中的免疫球蛋白大多数为丙种球蛋白（-球蛋白），有时丙种球蛋白也被混称为“免疫球蛋白”(immunoglobulin)。,.,3,（2）药理作用,注射丙种球蛋白是一种被动免疫疗法。它是把免疫球蛋白内含有的大量抗体输给受者，使之从低或无免疫状态很快达到暂时免疫保护状态。由于抗体与抗原相互作用起到直接中和毒素与杀死细菌和病毒。因此免疫球蛋白制品对预防细菌、病毒性感染有一定的作用。,.,4,（3）适应症,丙种球蛋白是血液中一种蛋白质，它通常来源于许多人献的血液，常被用来防止和治疗感染，对慢性疲劳症有显著的改善作用。适用于预防传染性肝炎，麻疹等病毒性疾病感染,，治疗先生性丙种球蛋白缺乏症，可提高对某些严重细菌性和病毒性疾病感染的疗效。,.,5,制备丙种球蛋白的方法,丙种球蛋白的两种分离制备的方法层析法（如：SephadexG-50）定义:是一种利用混合物中诸组分在两相间的分配原理以获得分离的方法。电泳法（如：聚丙烯酰胺凝胶电泳)定义：利用溶液中带有不同量的电荷的阳离子或阴离子，在外加电场中以不同的迁移速度向电极移动，而达到分离目的的分析方法。SEPHADEXG-50Sephadex是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形成的三维网状凝胶颗粒。Sephadex凝胶按交联度不同，用SephadexG加一个数字来区别型号,数字越小,表示介质交联度,分级范围越小，反之亦然。,.,6,电泳,作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。原理聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。,.,7,垂直平板：1多个样品在同一块凝胶上，电泳条件一致便于利用各种鉴定方法，直接比较各种样品区带，保证结果的准确可靠2可以进行双向电泳3电泳时热量容易消散，凝胶结果便于照相和易于制成干胶圆盘电泳：1、缺点是由于聚合效应，凝胶的长度和直径有细微差别，即使同一样品在两个凝胶柱上以同样的条件电泳，其结果也会不同2、但是研究工作中还会用到圆盘电泳，例如测定放射性标记的样品测定蛋白质的生物活性；测定蛋白质分离的最适pH，凝胶浓度；双向电泳中第一相的分离。,.,8,聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：凝胶透明，有弹性，机械性能好；化学性能稳定，与被分离物不起化学反应；对pH和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗作用；样品用量少，灵敏度可达10-6g;凝胶孔径可调节；分辨率高。凝胶系统的分类,.,9,1、连续性凝胶电泳连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应。,.,10,2、不连续凝胶电泳垂直电泳原理阴极电泳用水溶性树脂是一种阳离子型化合物，用有机酸中和，在水中溶解后，以分子和离子平衡状态存在于直流电场中，两极产生电位差，离子发生定向移动，阳离子向阴极移动，并在阴极表面上得到电子沉积于阴极表面，而阴离子向阳极移动，在阳极上放出电子氧化成酸。这就是电泳涂装的基本原理。它是一个非常复杂的电化学反应，其中包括：电解、电泳、电沉积、电渗四个同时进行的过程。,.,11,实验步骤,（1）溶液的配制a)a贮液为49.5%T,3%Cb)b贮液为49.5%T,6%C。c)胶缓冲液为3molTrisd)0.3g/LSDS用HCl调pH值至8145e)阳极缓冲液为0.2molTrisf)用HCl调pH值至8.9。g)阴极缓冲液为0.1molTrish)0.1molTricinei)0.13g/LSDS用HCl调pH值至8125。j)样品缓冲液为3molTris(pH8.45)k)0.8gSDSl)0.3molDTTm)少许溴酚蓝,定容至10ml。n)胶的制备:按文献分别配制分离胶、间隙胶和浓缩胶,依次灌胶。(2)样品处理去除血清白蛋白后的样品与2倍体积U9缓冲液(9molUrea,2%CHAPS,1%DTT)混匀,400600r/min冰浴振荡30min变性。取变性后样品与样品缓冲液等体积混匀,60水浴加热5min。(3)电泳内槽装阴极缓冲液,外槽用阳极缓冲液恒压电泳,先40V约1.5h,当样品进入分离胶时,电压升至60V约1.5h。,.,12,(4)染色和脱色电泳结束时,用双蒸水把胶面洗净。臵于染色液(0.1%甲醇,0.5%三氯乙酸,0.1%考马斯亮蓝G250)中,5060r/min,振荡染色1h。然后用双蒸水洗净胶面,转至双蒸水脱色,1h。更换双蒸水23ci直到背景清晰。盘状电泳圆盘电泳是带电粒子(胶体颗粒、离子等)在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象.广泛应用于生物大分子的分离和鉴定。它是利用丙烯酰胺和双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成大分子的凝胶物。它同时兼有分子筛和电泳效应。当样品通过凝胶进行电泳时，便可以根据其样品中各分子的电荷和分子量的不同而泳动出不同的区带。由于聚丙烯酰胺凝胶化学性质较琼脂稳定，很少带有侧基，在电泳过程中，吸附作用与电渗作用均小，所以该技术的分辨率均高于其它琼脂电泳技术。,.,13,聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应,1、浓缩效应每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。有效电荷多的，泳动的快，反之则慢。2、电荷效应分子量大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受凝胶阻滞的程度不同，表现出不同的迁移率。3、分子筛效应样品在分离之前，首先在浓缩胶得到浓缩，变成狭窄（很薄）的样品带，使分辨率大大提高。,.,14,实验方法分离胶的制备浓缩胶的制备待分离样品的准备加样电泳染色脱色,.,15,材料与试剂,120单体母液丙烯酰胺（Aorylamide）19.60g双丙烯酰胺（N，NmethyleneBisaerylamide）0.40gH2O加至100.00ml2pH8.0TrisEDTA缓冲液Tris（三羟基甲基氨基甲烷）6.05gEDTA（乙二胺四乙酸）1.17gH2O加至100.00ml3B三甲基胺基丙腈液（BDMPN）（Dimethylaminopropionitrile），原液于4冰箱保存410过硫酸铵溶液过硫酸铵0.50gH2O加至5.00ml现用现配或配后低温保存不超过一周。50.025Mol/LpH9.0硼酸缓冲液硼酸3.948g硼砂30.512gH2O加至1000.0ml使用时取该液90ml加H2O至1440ml，即为电泳液。,.,16,五、操作步骤,1、分离胶的制备：（1）、将清洁、无破碎干燥的小玻管一端，用胶布贴封后，朝下垂直放入有机玻璃凝胶玻管架的孔中，并在小玻管的7.0cm处作一记号。（2）用自动取液器吸取上述配好的分离凝胶贮液沿着小玻管内壁小心准确加入7.0cm高。（3）凝胶溶液加毕后，随即吸取蒸馏水，加至管中的凝胶表面，使其表面覆盖一水层（水封，1.0cm高）。在灌胶和封水的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。（4）将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约30-60分钟后，待界面出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，即可加浓缩胶。2、浓缩胶的制备：（1）、轻轻倒掉分离胶玻管上端的液体，并用吸水纸吸去未倒净的液体（但不能触及胶面）然后先小心用浓缩胶贮液洗涤凝胶表面1-2次，再小心加入该浓缩胶贮液1.5cm高。（2）、随后同样加1.0cm高的蒸馏水层覆盖胶表面。大约也在20-40分钟后，待浓缩胶出现乳白色时，表明胶已聚合完毕。,.,17,3、加样：取一根上次做好的凝胶小玻管用吸水纸轻轻吸去浓缩胶表面上的水层，然后用微量注射器加10ul测试样品溶液。4、装置凝胶管：将加好样品的凝胶管的加样端（上端），插入上电泳槽孔中，然后将已插满凝胶管的上电泳槽放入加有电极溶液的下电泳槽内。此时凝胶玻管下端管口易产生气泡，可通过轻轻摆动凝胶玻管以去除气泡，插入上电泳槽的玻管上端，用滴管轻轻滴满电极溶液，以免产生气泡，最后将上电泳槽装满电极液。,.,18,5、接通电源：接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，上槽电极接负极，下槽电极接正极，稳压300V电泳开始时，电流应由小逐步加大至额定值。这时的电流大约每管3.05.0mA电流，直至指示剂前沿到达凝胶管底部约0.5cm处，（大约需时2小时），停止电泳。确定电泳结束时，不应将溴酚兰跑出凝胶管，以防止标准分子量中的最低分子量蛋白质也跑出凝胶管。6、练习取出玻管内的凝胶：将一支带有长针头的注射器吸有适量水（蒸馏水或自来水），把针头慢慢插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，一边开始压水，一边同时使针头慢慢贴紧管壁呈螺旋式前进，如果一端不行，再在管的另一端按同样的方法剥离，这样依靠水流的压力和滑润力，使玻管内壁与凝胶分离，最后用洗耳球在管的一端轻轻挤压，另一端对着一干净大小适宜的培养皿内，此时可以将凝胶柱压出玻管。,.,19,7、取出玻管内的凝胶8、凝胶染色：将取出的凝胶柱，放入一合适干净的培养皿内，然后加入适量染色液，于摇床上进行振摇染色30分钟，完毕，回收染色液，用清水洗凝胶柱2-3遍。在染色的同时，凝胶中蛋白质区带亦被固定。9、凝胶脱色：在培养皿（或试管）内加入适量脱色液于摇床上进行振摇（2小时/次，需3次）脱色多次直至色带完全清晰为止。10、绘图：最后根据染色所出现的带数和位置进行绘图，以确定被分析样品的组分。另一种方法是通过密度扫描仪扫出各组分的峰形位置，这样不仅能确定组分，而且能比较出各组分所占比例（如果要计算出各分离区带的相对迁移率，可参考教课书）。,.,20,注意事项样品的离子强度、pH值尽可能与浓缩胶溶液相同，如含大量