免疫组织化学技术2.ppt

1,免疫化学技术在科研及临床中的运用,2,免疫化学技术,一、免疫细胞化学,二、免疫组织化学,三、免疫荧光组织化学,3,一、免疫细胞化学,1、定义：利用已知抗体检测细胞爬片上细胞是否存在相应的抗原。2、原理：抗体+细胞抗原-显色3、运用：检测相关基因的表达,4,5,二、免疫组织化学Immunohistochemistry,IHC,原理用途试剂配置操作步骤,6,免疫组织化学技术定义和原理,免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）技术是指在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织呈色反应，借助可见的标记物，对相应的抗原或抗体进行定位、定性和定量检测的一种方法。,“IHCmakesitpossibletovisualizethedistributionandlocalizationofspecificcellularcomponentswithincellsandinthepropertissuecontext.”,7,标记抗体,标记的抗原抗体复合物,免疫组织化学反应原理,组织抗原,1荧光素2酶标3金属离子4同位素,HPR-DAB显色呈棕黄色,8,间接法:灵敏性三步法、两步法,直接法：特异性一步法,两种免疫组织化学反应方法,9,亲和素-生物素方法（三步法）：ABC、SP法,多聚螯合物酶法（两步法）：Supervision法,10,用途,临床病理诊断：肿瘤分类诊断上皮来源：CK，EMA间叶来源：Vimentin淋巴组织:LCA科研：组织抗原表达情况,11,试剂准备,切片(防脱片),多聚赖氨酸,APES,一抗,多抗or单抗,兔or鼠,注意种属特异性，针对检测组织种属,检测试剂盒,EliVisionTMplus检测试剂盒（二步法）SP试剂盒（三步法）链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法SABC试剂盒（三步法）,显色试剂盒,DAB试剂盒,其他,H2O2，二甲苯，酒精，缓冲液（PBS，柠檬酸缓冲液），抗原修复液，正常动物非免疫血清,12,（1）使用多聚赖氨酸防脱载玻片贴4m石蜡切片。（2）60烤片1小时。（3）切片脱蜡至水。（4）蛋白酶消化或抗原热修复（此步视一抗及组织具体情况而定）。（5）PBS洗3min3次。（6）组织切片于室温下置于3%H2O2水溶液中15-20min以阻断内源性过氧化物酶。（7）PBS洗3min3次。（8）滴加非免疫动物血清，室温孵育20min，封闭抗体非特异性结合位点。,NO1.前期处理（抗原准备阶段）,免疫（酶）组织化学基本步骤,13,（9）甩去非免疫动物血清，直接滴加适当稀释的特异性一抗，37孵育90-120min。（10）PBS洗3min3次。（11）滴加二抗（二抗操作步骤视选用的免疫酶组织化学方法而定）（12）PBS洗5min3次。（13）DAB或AEC显色3-10min，显微镜下监控显色程度，水洗。（14）苏木精复染，水洗。（15）1%盐酸酒精分化数秒，水洗。（16）饱和碳酸锂水溶液返蓝，水洗。（17）梯度酒精脱水，透明，封片。,NO2.免疫反应阶段,NO3.显色反应阶段,14,结果分析和判断,（1）判断原则（2）对照设计（3）非特异染色（4）失败的原因及其处置方法,15,（1）判断原则,必须设立染色对照：阴性对照，阳性对照抗原表达必须在特定部位：胞膜、核、浆尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达对免疫组化标记结果的意义不能绝对化,16,阴性,17,CK胞浆阳性,18,胞浆阳性,19,细胞核阳性-PCNA,20,胞核阳性,21,胞膜阳性,22,胞膜阳性,23,（2）对照设计,阳性对照：已知阳性表达的组织自身对照：同一标本中不同组织对照阴性对照：A、阴性组织对照：已知阴性表达的组织B、阴性试剂对照：空白对照,24,（3）非特异性染色,原因,组织内源性成分的干扰：内源性过氧化物酶-白细胞，红细胞内源性生物素-肝、胰、肾组织,组织处理不当：内源性过氧化物酶-白细胞，红细胞内源性生物素-肝、胰、肾组织,25,（3）非特异性染色,处理方法,抗体：纯化，浓度，时间，温度,封闭：H2O2，非免疫动物血清,清洗：充分,显色：时间,其他：脱蜡充分，无干片,26,（4）染色失败的原因及处理方法,试验片：-阳性对照片：-阴性对照片：-空白对照片：-,结果：假阴性,原因：操作步骤？试剂？,27,试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：+空白对照片：+,结果：假阳性,原因：切片干涸抗体浓度过高缓冲液配制不对冲洗不彻底显色液配制不对显色时间过长载玻片的粘合剂过厚,28,试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：-空白对照片：+,结果：假阳性,原因：非特异染色，与二抗交叉反应。,29,试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：+空白对照片：-,结果：可疑阳性,原因：阴性对照组织选择不准确，含有靶抗原,30,试验片：+阳性对照片：+阴性对照片：-空白对照片：-,结果：阳性,原因：方法可靠，实验片含靶抗原。,31,阴性对照切片-，阳性对照标本和待检测切片呈弱阳性,原因：标本固定不当抗体试剂问题：浓度、效价低抗原修复不当显色时间短,32,切片染色深或整张切片出现染色,抗体浓度过高切片显色时间过长组织没有正确封闭冲洗不够充分,33,切片出现非特异性背景染色,内源性过氧化物酶、内源性生物素过多血清封闭时间过短抗体不纯组织片内出血或坏死成分冲洗不彻底,34,三、免疫荧光及免疫酶标,35,双重或多重免疫荧光标记染色,FITC-绿色,TRITC-红色,绿色+红色-黄色,36,双重或多重免疫酶标记染色,双酶双标记,紫蓝色：AKP/NBT,黄色：HRP/AEC,37,双重或多重免疫酶标记染色,单酶双底物,HRP-DAB：棕色,镍-鈷：黑色,上皮：黑色淋巴：棕色,38,Thankyouforattention!,39,胞核阳性,40,ABC法：ABC代表的是亲和素生物素过氧化物酶复合物。利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。但是此法注意内源性生物素活性的消除，以减少非特异性的染色。SP法：是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的碱性磷酸酶及底物色素混合液来测定细胞或组织中的抗原。PA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，它能与各种动物的IGG的FC段结合，在免疫组化中可作为桥抗体或标记抗体。最大的优点是不受种属的特异性限制。此法还具有染色时间短、灵敏度高、背景染色淡等优点，分子量小，易于穿透组织。两者本质的区别是：SABC法的“三抗”是SABC复合物即链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物；而SP法的“三抗”是过氧化物酶直接与链酶亲和素相连的，没有通过生物素的中介连接。SABC步骤：切片常规脱蜡、脱水；30H2O2蒸馏水10份混合，室温510分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗；将切片浸入0.01M枸橼酸盐（PH6.0），微波炉加热至沸腾后断电，间隔10分钟，反复两次进行热修复抗原；滴加5BSA封闭液，室温20分钟；滴加一抗，371小时30分钟孵育；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温下20分钟，PBS（PH7.27.6）洗；滴加试剂SABC，室温下20分钟，PBS洗5分钟4次；DAB显色：取1ml蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色18分钟；苏木素轻度复染；脱水，透明封片。显微镜下观察。,41,高压修复,pH=6.0柠檬酸盐缓冲液大火