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岛津液相色谱维护培训,第一部分液相色谱故障排除经验液相色谱常见问题,LC10Avp,LC-20AProminence,液相色谱简易流程图,1.（简单）等度系统,储液瓶,脱气机,泵单元,手动进样器,色谱柱,检测器,废液瓶,1234567,2.低压梯度系统,123456789,3.高压梯度系统,12345678,液相色谱故障排除经验,故障的确定至少要重复出现两次以上初步判断故障引起的原因方法或硬件由经验或平时的积累确定故障原因平时做好观察和记录当不能确认故障原因时采用排除法逐一考察可能引起故障的因素确定故障能否自行处理不要贸然拆卸不熟悉的部件,常见故障因素,仪器环境：实验室的温度、湿度、酸度等实验室震动、灰尘等问题电源及地线问题使用条件：流动相（pH值、均匀度、气泡等）样品（样品分解、氧化、样品溶剂等）色谱柱（污染、堵塞、塌陷等）硬件问题：输液泵进样器检测器,平常保养,-做好平常的保养可以有效的降低故障的发生率-做好平常的保养可以延长仪器的使用寿命常做的保养保持仪器的环境（经常清洁仪器，尤其是灰尘）泵的保养（使用缓冲盐时要清洗柱塞，水和盐不长期保存在泵里）进样器要经常清洗，避免污染物吸附或堵塞管路尽量进行样品前处理色谱柱要定期清洗，保证柱效及使用寿命系统中不要长期保存水和盐，长时间不用时应将仪器所有部分全部更换为70以上的甲醇，避免细菌的滋生及盐的析出。,液相色谱常见问题,压力异常（偏高、波动）漏液保留时间漂移基线问题（漂移、噪声）峰形异常,压力,压力是液相色谱中最重要的指标，要经常关注压力的变化。保留时间的变化经常是由于压力问题引起的。不同溶剂即使在相同流速和温度的情况下压力也是不同的。记下仪器正常状态时，在一定条件下（流速、温度）的压力显示值。,压力高时,首先要确认是色谱柱堵塞还是系统堵塞色谱柱堵时：确认可能造成堵塞的样品的性质，相应选择合适的清洗溶剂。系统堵塞，首先应确认是那一部份堵塞，依据情况排除。,容易发生堵塞的部件,保护柱及色谱柱线路过滤器管路连接处进样器检测器流通池,压力低,如果压力为零：泵头中没有液体，而是充满了气泡单向阀完全堵死柱塞杆折断压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力)如果有压力但是压力比正常时低：漏液单向阀堵塞,压力波动,压力在短时间内剧烈波动。,泵头中有气泡单向阀脏柱塞密封圈漏液,经常漏液的部件,泵：柱塞密封圈排液阀手动进样器：转子密封圈磨损检测器：流通池窗口（垫片损坏、透镜破碎）接头处漏液：（接头松动，接头脏，接头磨损，部件不匹配）,保留时间不稳定,吸滤头脏泵输液不正常（压力波动、气泡等）流动相组分变化流动相缓冲能力不够色谱柱平衡时间不够柱温的变化柱子问题,噪音大,流动相污染、变质或由低质溶剂配成有地方漏液流动相、泵、检测器流通池内有气泡流动相各溶剂不相溶或混和不均匀检测池能量不足流通池被污染温度影响（检测器和柱温差别太大）其他电子设备的影响,基线漂移,流动相污染，变质或由低品质溶剂配成流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂)温度波动柱子平衡时间不够流通池被污染或有气泡流通池窗口破裂,峰形问题,死体积太大柱子被污染或堵塞色谱柱塌陷色谱柱化学或次级保留（硅羟基效应）色谱柱被重金属污染流动相缓冲不足或不合适样品溶剂选择不当，与流动相之间极性差异太大样品过载（浓度或体积）柱温过低,鬼峰,流动相被污染进样阀残余峰样品中未知物色谱柱中的污染物,第二部分日常使用注意点硬件基础知识容易出故障的部件及常见故障的排除,液相系统维护流程图,色谱柱,一、输液部分,管线选择,材料不锈钢TeflonPEEK(聚醚醚酮)尺寸0.1mmI.D.x1.6mmO.D.0.3mmI.D.x1.6mmO.D.0.5mmI.D.x1.6mmO.D.0.8mmI.D.x1.6mmO.D.,管线材料,不锈钢(可用于所有连接)能承受几千kgf/cm2压力酸性或高浓度盐环境中易腐蚀(尤其在pH小于2时)PEEK(可用于所有连接)能承受高达250kgf/cm2压力可在整个PH范围(pH1-14)内使用不适用于高溶解性溶剂如氯仿等Teflon(用于柱后阻尼管、反应管和排液管)化学惰性大能承受5kgf/cm2压力,接头,不锈钢接头/垫圈主要用于输液泵、进样器的连接能承受400kgf/cm2压力一旦固定，垫圈不可再动PEEK接头主要用于色谱柱、检测器的连接易于安装能承受250kgf/cm2压力容易产生死体积,不锈钢接头,垫圈,PEEK接头,死体积,死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题.,管线,公螺母,死体积,好的连接,差的连接,选择原则采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配,流动相,溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯,都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒）,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,微量分析、梯度洗脱,流动相,水/甲醇梯度ODS柱,鬼峰,GradientCurve,1ml/min,0-100%MeOHover10minsandholdfor15mins.,鬼峰的出现,流动相,水的等级纯化水蒸馏水去离子水,波长(nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,吸光率,流动相,选择缓冲液的步骤1.确定最佳分离状态时的流动相pH2.选择具有与流动相的pH相近的pKa的缓冲液（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）3.确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液）,流动相,代表性弱酸的pKa,流动相,缓冲液的使用,使用前必须过滤使用后一定要对柱子进行清洗，以免造成腐蚀、磨损及阻塞:首先用510的甲醇水溶液冲洗10-30min（0.5-1ml/min），再用甲醇冲洗30min(0.1-0.5ml/min)易受到细菌和霉菌的影响,注意冲洗次序，不能直接用有机溶剂冲洗,流动相,流动相的更换,不互溶的流动相不能直接更换,缓冲盐不能直接用有机溶剂更换,水,正己烷,异丙醇,缓冲盐,有机溶剂,水,过滤：0.45um或更小孔径滤膜目的：除去溶剂中的微小物理颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是在使用无机盐配制的缓冲液的时候必须过滤脱气：除去在流动相中溶解或彼此混合而产生的气泡气泡对测定的影响：1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形3）检测器中的气泡产生基线波动无在线脱气应注意：1）每天脱气2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长,溶剂前处理,流动相处理,LC-20A日常维护输液泵,清洗方法：异丙醇超声5min。,LC-20A日常维护输液泵LC-20AD/AB,LC-20A日常维护输液泵LC-20AT,LC-20AT,吸滤头,吸滤头部件号：228-45707-91,吸滤头部件号：228-21984-01,吸滤头,材料：不锈钢烧结(或陶瓷），孔径10um故障：堵塞表现：管路中不断有气泡生成措施：用异丙醇（或5稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗,泵工作示意图,流动相入口,流动相出口,单向阀,T泵：串联式往复泵,D泵：并联式往复泵,LC-20AT,LC-20AT,LC-20AD,单向阀,单向阀结构,球座,单向阀工作原理,单向阀结构,请不要分解阀心A和阀心B重新组装后性能不被保证，输液可能不稳定,注意：,LC20AT主入口阀部件号:228-45704-92,LC20AD入口阀LC20AT副入口阀部件号:228-45704-91,LC20AD出口阀部件号:228-45705-91,单向阀,LC10ADvp出口阀LC10ATvp出口阀部件号:228-34976-91,LC10ADvp入口阀部件号:228-39093-92,LC10ATvp入口阀部件号:228-32166-91,单向阀清洗,故障：宝石球或球座受污导致密封不好表现：系统压力波动大措施：打开排液阀，以异丙醇为流动相输液拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗,注意：超声清洗时开口端向上放置。,View,故障：宝石球粘附于垫片表现：泵无法吸液或排液，流路不通措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球与垫片分开2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗,单向阀清洗,View,柱塞密封圈,柱塞密封圈LC-20ADLC-20ABLC-10ADvp部件号228-35146,柱塞密封圈LC-20ATLC-10ATvp部件号：228-35145,取下和安装柱塞密封圈工具,柱塞密封圈的更换,故障：密封圈磨损导致密封不良现象：系统压力波动大或漏液措施：更换密封圈注意点：拆卸泵头前，柱塞杆复位（PSET）,流动相,泵头清洗管路,柱塞杆,密封圈,View,柱塞杆,柱塞杆LC-10ADvp用部件号：228-35281-91,柱塞杆LC-10ATvp用部件号：228-35009-92,柱塞杆LC-20AD/LC-20AB用部件号：228-35281-95,柱塞杆LC-20AT用部件号：228-35009-93,柱塞杆更换,更换柱塞密封圈后仍然漏液时；柱塞密封圈使用寿命短时；柱塞杆损伤时，应更换柱塞杆。,柱塞隔膜,更换柱塞时，应同时更换隔膜。隔膜损坏导致泵头后部漏液时，应更换隔膜。注意：只有D系列泵有隔膜，T系列泵由于设计不同，没有隔膜。,隔膜LC-20AD/LC-20AB/LC-10ADvp用部件号：228-32784-91,View,线路过滤器,故障：堵塞现象：系统压力偏高措施：异丙醇（或5稀硝酸），超声波清洗判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力5kgf/cm2，则堵塞。,线路过滤器部件号：228-32744,过滤器的更换,旧过滤器的取出,新过滤器的安装,排液阀漏液,故障：排液阀垫圈损伤或密封不良现象：打开排液阀进行排气时，从装有排液阀的螺口处漏液措施：排液阀手柄按逆时针方向旋转取下，确认垫圈表面有否损伤。有损伤，进行更换；附有脏物，擦洗掉，再确认。,LC-20A系列泵部件号：228-45574-91,LC-10Avp系列泵部件号：670-11518,排液阀,混合器,混合器不同体积的连接方法,等度洗脱,梯度洗脱装置：高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。,高压/低压梯度系统,分析时间长,分离度差,MeOH/H2O=6/4,MeOH/H2O=8/2,(column:ODS),使用梯度洗脱的原因,当等度洗脱时：,95%,30%,甲醇浓度,在最短时间内获得最佳的分离,使用梯度洗脱的原因,当采用梯度洗脱时：,梯度洗脱形式：线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系折线梯度：,梯度洗脱方式,梯度洗脱形式的选择,梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度注意事项：溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）查看空白实验的数据遵守分析周期。（最初的分析数据不采用）,梯度洗脱要点,1.使用流动相溶解样品-减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时由为重要-保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中尤其在柱中产生沉淀2.进样前最好使用0.45um的膜进行过滤如果样品很脏，要使用0.2um的膜进行过滤3.对于含有复杂基质的样品，最好过前处理小柱后再进样。,样品前处理,混合器过滤组件,常见故障：堵塞混合器堵塞往往是由于混合器过滤组件堵塞引起的。处理方法：按图中结构卸下过滤组件，5%稀硝酸或其他溶剂超生清洗或更换新的组件,标准或半微量混合器用部件号：228-18872-93,二、进样部分,进样器,自动进样器手动进样器(7725/7725i）原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入2）部分注入,7725i手动进样阀,手动进样器的原理图,7725/7725i手动进样器结构图,定子密封部件号：228-32211-31,转子密封(Vespel)部件号：670-12098-51(Tefzel)部件号：670-12098-56,转子密封适用范围,进样量和检测器响应的关系示意图,进样量,定量环体积一半,三倍定量环体积,全量注入,部分注入,响应值,交叉污染的原因,微量注射器,红色表示残留样品,进样口清洗,（1）将附件进样口清洗器安在注射器上。（2）清洗液（试样溶剂或不含盐的流动相等）用注射器吸入（3）在进样状态下，将针孔清洗器压接在针导管上，流入清洗液1ml左右（4）使用缓冲盐后，用水清洗流路和针孔（5）不应用微型注射器清洗（6）清洗液可能反喷，因此注射器应慢慢地推压,手动进样器,操作注意点：1）进样时，进样针应插到底2）不使用时将针头留在进样器内3）进样应使用液相色谱专用平头进样针4）样品溶液pH小于10,常用密封垫的Vespel材质，适用pH10,否则换Tefzel或PEEK材质的密封垫pH0-145）清洗应使用专用针口清洗器,故障处理,漏液如果液体从定子和定子环之间流出、或从针孔流出，或从排液口流出，上紧压力调整螺钉，如果不成功更换转子或定子面组件针密封漏液针的外径由于有偏差，在使用比针外径小的注射器时，进样口不能严实密封，产生漏液，使进样量不准。从进样口取出针，用铅笔的橡皮头将针导管压入，针密封上承受压力使孔变小达到严实密封。,三、分离部分,色谱柱的日常保养,购买新柱后一定要仔细阅读说明书，确认柱的使用条件以及清洗再生步骤，按照说明书条件测试色谱柱柱效，记录使用压力定期检测柱压和柱效不同流动相之间转换时应注意溶剂的互溶性确认样品不会在流动相中析出或带有固体不溶物，请使用0.45um或0.2um的一次性滤膜过滤样品，或者进行前处理。为了延长色谱柱使用寿命，请使用保护柱。定期用合适的溶剂清洗或再生色谱柱长期不用时，清洗干净后，使用柱子说明书中指明的溶剂保存。柱子要从仪器上卸下并用堵头密封后保存。定期用合适的流动相清洗保存的柱子，避免干涸。,峰的变形,根部变宽,有肩或分叉,峰产生有肩或分叉的原因,1.柱子劣化（进口处产生不均匀的空隙）2.样品劣化（生成氧化物、分解物等）,判断标准所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化,色谱柱柱效降低原因,滤片或填料堵塞样品或流动相中杂质吸附机械振动产生空隙填料变性,滤片或填料堵塞,使用预柱缓冲液和溶剂使用0.45um滤膜过滤样品溶液使用0.45um滤膜过滤反向连接色谱柱，使用清洗溶剂以小流量送液打开柱头，清洗或更换滤片,样品或流动相中杂质吸附,杂质会产生拖尾峰使用高溶解性溶剂清洗色谱柱,仅几毫米深度会被污染,色谱柱,取出污染填料，装填新的填料,机械振动产生空隙,不要撞击色谱柱，如：色谱柱掉落或柱压急剧变化。,色谱柱类型,色谱柱的类型及适用范围,产生峰变形的原因,柱进口污染柱内存在空隙样品过载溶解样品的溶剂选择不当二次保留效应担体表面存在硅醇基担体表面残留重金属,溶解样品的溶剂选择不当,最好不要选择高溶解性的试剂作为溶解样品的溶剂,最好注入少量样品,柱温箱,分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性,常用检测器,紫外检测器（包括二极管阵列检测器）荧光检测器示差折光检测器电导检测器蒸发光散射检测器质谱检测器,原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：朗伯比耳定律，AKCL优点：1）灵敏度高2）对温度和流速不敏感3）可用于梯度洗提缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质,紫外检测器,二极管阵列检测器,二极管阵列检测器（SPD-M20A）-二十一世纪标准紫外检测器色谱定性依据：保留时间常规紫外检测器峰纯度二极管阵列检测器,二极管阵列检测器,样品池,二极管阵列,光栅,D2/W灯,每一组分可在每一波长处得到一吸光度值,二极管阵列检测器,1）采集三维谱图2）峰纯度检验3）光谱库检索4）可以发现单波长检测时未测到的峰,二极管阵列检测器的优点,原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测优点：1）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一2）选择性好3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系）,荧光检测器,原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。优点：通用型检测器，缺点：1）对温度变化敏感2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测3）属于中等灵敏度的检测器,示差折光检测器,原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。广泛应用于离子色谱法优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱缺点：对温度变化敏感（每升高1度，电导率增加2%-2.5%)用途：主要用于离子色谱检测水溶性无机和有机离子,电导检测器,原理:色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速氮气喷成雾状液滴，溶质形成不挥发的微小颗粒，被载气带到检测系统。进入散射室中，检验散射光的强度。优点:消除了溶剂干扰以及温度变化带来的基线漂移，可梯度洗脱，灵敏度高缺点：不能使用不挥发性性盐做流动相，如磷酸盐。,蒸发光散射检测器,质谱检测器,强大的定性和选择性能力多组份样品的准确定性；未充分分离组份峰的鉴别；消除杂质干扰；可作为便捷的定性分析用于合成和衍生反应的研究；作NMR预分析的质谱鉴定；,四、检测部分,紫外检测器光路图,紫外检测器,参比