细菌内毒素检查法

85细菌内毒素检查USP37设备验证过程中使用的所有玻璃器皿和耐热材料都放在干热灭菌箱中，以去除热原。最小灭菌时间和温度一般为30分钟和250。如果您需要使用塑料器皿，如与自动进样器配套的微孔板或吸头，您应该选择标记有无内毒素和对测试无干扰的仪器。注：在本章中，“管”是指任何其他反应容器，如微量滴定管试剂和测试溶液阿米巴溶胞产物(鲎试剂)鲎试剂是从寄生在鲎(鲎或鲎阿米巴细胞)中的阿米巴溶胞产物(白细胞)中获得的冻干产品。试剂符合相关法律法规的要求。注释：鲎试剂会与-葡聚糖反应，但内毒素除外。该鲎试剂可用于不与葡聚糖反应，并可用于在葡聚糖存在下的内毒素检查，通过除去阿米巴溶胞产物中可与葡聚糖反应的G因子或抑制阿米巴溶胞产物的G因子反应系统。】细菌内毒素检查水(BET)是注射用水或在灵敏度极限内不与鲎试剂反应的其他水。溶解细菌溶液测试溶液在缓慢搅拌下，将阿米巴溶胞产物(鲎试剂)溶解在鲎试剂制造商推荐的BET测试水或缓冲液中，重组鲎试剂根据生产要求储存，并冷藏或冷冻。溶液的制备：标准内毒素储备液标准内毒素储备液是根据包装上的说明以及标准内毒素储备液在制剂标签上的储存和制备方法制备的，使用的是经现行世卫组织国际标准校准的美国药典内毒素标准。内毒素由欧盟表示。注：1EU=1IU内毒素标准溶液将内毒素储备溶液混合均匀，然后用水稀释进行细菌内毒素检查。应尽快使用稀释剂，以避免因吸附而失活。测试溶液测试溶液是通过用水溶解和稀释药物进行细菌内毒素测试而制备的。一些物质或制剂可能更适合溶解和稀释在其他水溶液中。如有必要，调整待测溶液的酸碱度，使鲎试剂和样品混合物的酸碱度在鲎试剂制造商设定的酸碱度范围内。通常用于酸碱度在6.0至8.0之间的产品。可通过酸、碱或鲎试剂制造商推荐的适当缓冲液来调节酸碱度。酸和碱可以用已去除内毒素的容器中的浓缩液或固体和细菌内毒素测试水来制备。必须验证缓冲液不含内毒素和干扰因素。添加的最大有效稀释剂的测定最大有效稀释剂是指允许样品在内毒素限值内测试的最大稀释剂范围。使用以下公式确定最大值：MVD=(内毒素限值试验溶液浓度)/()内毒素限值注射药物的内毒素限值取决于剂量，等于K/M2，其中K是每千克体重内毒素的阈值热剂量；m是每千克体重产品的最大推荐剂量。当定期进行频繁注射和连续输注时，m指每小时给药的最大总剂量。在药典中，注射用药物的内毒素限值规定为欧盟/毫升、欧盟/毫克、欧盟/单位生物活性等。测试溶液的浓缩液当以毫克/毫升表示的内毒素被指定为重量时(欧盟/毫克)；如果单位/毫升内毒素指定为重量(单位生物活性)；当以毫升/毫升表示的内毒素被指定为重量时(欧盟/毫升)。凝胶法(EU/mL)或浊度法和显色法最低浓度标准曲线的标记灵敏度。凝胶法凝胶法系统利用鲎试剂和内毒素之间的凝集原理来检测或定量内毒素。在标准条件下，凝集鲎试剂的最低内毒素浓度是鲎试剂的标记灵敏度。为了保证实验的准确性和有效性，进行了以下制备实验，以确定鲎试剂的标记灵敏度和干扰因素。准备实验鲎试剂标记灵敏度的确认在使用本实验之前，应至少使用4种鲎试剂来确认标记灵敏度(单位为欧盟/毫升)。当李牧的新批号取一个装有等体积(如0.1毫升)鲎试剂溶液的试管，加入0.1毫升不同浓度的内毒素标准溶液混合。如果使用冻干鲎试剂的单个测试体积小瓶或安瓿，可以直接添加上述溶液。根据制造商的说明，将反应混合物培养一段恒定的时间(通常在371下培养602分钟)，以避免摇动。为了测试凝胶的完整性，将试管依次从恒温器中取出，并缓慢翻转180。如果凝胶在试管中形成，并且倒置时没有从试管壁上滑落，则为阳性。如果没有形成完整的凝胶，则为阴性。在所有平行试验中，最低浓度标准溶液为阴性，这是有效的。反应的终点是指标准内毒素的最低浓度，该浓度将使鲎试剂浓缩至一系列降低的水平。反应终点的几何平均值是通过在四个平行试验中取反应终点浓度的对数平均值，然后取平均值的真值计算的，如下所示：终点浓度的几何平均值=antilog(/f f)是一系列反应结束时浓度的对数之和，f是重复试管的数量。反应结束时浓度的几何平均值是鲎试剂灵敏度的测量值(欧盟/毫升)。当该值在0.5和2之间时，灵敏度被确认并可用于内毒素检测。凝胶法干扰因素试验应根据表1制备溶液A、B、C和D。抑制/增强试验中使用的试验溶液应为未检测到内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液，并应根据上述鲎试剂灵敏度审查试验程序进行操作。溶液B和C的反应终点浓度的几何平均值根据鲎试剂灵敏度确认试验公式计算。解决办法内毒素浓度/加入内毒素的溶液稀释液稀释倍数内毒素的初始浓度并行测试的数量嗜酒者互诫协会Bb复写的副本Dd未添加/测试样品溶液2/测试溶液2/细菌内毒素检查用水无附加/细菌内毒素测试水试液细菌内毒素检查用水12481248210.50.25210.50.254444422222解决方案a:不进行内毒素检查的试验品解决方案b:测试物品的干扰测试溶液C:标记鲎试剂灵敏度的控制溶液d:细菌内毒素试验阴性对照水仅当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行试管均为阴性且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度审查范围内时，该试验才有效。如果溶液B的检测结果能反映出鲎试剂在受试物存在下的灵敏度，当其测定值为0.5-2.0时，认为受试物溶液在该浓度下不会干扰试验，否则必须进行干扰试验。如果试样溶液在小于最大允许值的稀释倍数下干扰试验，则试样溶液应进一步稀释至不超过最大允许值，并重复干扰试验。干扰可以通过使用稀释的测试样品和更大倍数的测试来消除。可以采用适当的处理方法(如过滤、中和、透析或热处理)来消除干扰。在不损失内毒素的基础上，通过以下试验确定干扰消除方法的建立。加入标准内毒素的样品用选定的去除方法处理后，应重复干扰试验。极限测试操作方法：根据表2准备溶液a、b、c和d。根据鲎试剂灵敏度确认检验项目进行检验。表2。凝胶极限测试溶液的制备解决方案*内毒素浓度/添加的内毒素浓度平行试管的数量A没有添加/稀释样品溶液2B2/稀释的测试溶液2C2/细菌内毒素检查用水2D无水添加/细菌内毒素检查2*使用凝胶法制备试验-凝胶法干扰因子试验中的处理液A和阳性对照液B，稀释比不大于最大允许值。阳性对照溶液B和C含有标准内毒素制剂，其灵敏度是相应标记鲎试剂的两倍。阴性对照溶液D是鲎试剂水。这表明如果阳性对照溶液的平行管当溶液A的两个平行试管中的一个为阳性，另一个为阴性时，需要重新测试。如果溶液A的两个平行管在第二次面试中为阴性，则测试物品被确定为符合规定。如果溶液A的一个或两个试管在复试中呈阳性，则该测试物品被确定为不符合规定。如果样品溶液的稀释倍数小于最大允许值，则需要进一步稀释不超过最大允许值的溶液，并进行重新测试。定量试验操作该方法通过测定反应终点的浓度来量化测试样品中内毒素的含量。根据表3制备溶液A、B、C和D，并根据鲎试剂的灵敏度确认试验项目下的操作。表3凝胶定量测试溶液的制备解决办法内毒素浓度/加入内毒素的溶液稀释液稀释倍数内毒素含量平行管的数量嗜酒者互诫协会未添加/测试样品溶液细菌内毒素检查用水12482222Bb2/测试溶液122复写的副本2/细菌内毒素检查用水细菌内毒素检查用水1248210.50.252222Dd无附加/细菌内毒素测试水2溶液A:测试样品的稀释剂不超过干扰测试的最大限制稀释倍数。测试溶液的后续稀释不得超过最大极限稀释倍数。用四管水稀释细菌内毒素试验，分别为1、1/2、1/4和1/8。相关稀释度用于干扰试验，也可使用其他合适的稀释度。b溶液b:含有2细菌内毒素的溶液a(供试品阳性对照)溶液C:稀释两个系列的4支管，标准内毒素浓度为2，1，0.5，0.25。溶液d:细菌内毒素检查水(阴性对照)。如果计算并确定满足以下三个条件，则试验有效：(1) 2个阴性对照D溶液试管为阴性；(2)阳性对照溶液B的两个试管为阳性；(3)溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5至2的范围内。对溶液A进行内毒素检测，得到每系列稀释溶液的反应终点稀释率，将反应终点稀释率乘以，得到溶液A的反应终点浓度。平行管的反应终点浓度即为样品的反应终点浓度。如果在测试中选择了测试物品的稀释度，则通过将计算结果乘以测试物品的稀释倍数来获得测试物品的细菌内毒素浓度。在有效试验中，如果试验溶液的每次稀释都