琼脂糖凝胶电泳注意事项PPT课件

.,1,琼脂糖凝胶电泳操作及其注意事项,欢迎大家一起交流！,.,2,什么是电泳？,带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。生物大分子如蛋白质,核酸,多糖等大多都有阳离子和阴离子基团,称为两性离子在电场中,带电颗粒向正极或负极迁移,迁移的方向取决于它们带电的符号。,.,3,按分离原理的不同，电泳分为4类:移动界面电泳区带电泳等电聚焦电泳等速电泳,电泳有几类？,.,4,琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。,琼脂糖凝胶电泳原理,.,5,琼脂糖凝胶电泳的操作,操作步骤配胶点样电泳成像拍照EB染色胶图分析,.,6,1、配胶,按所要分离的DNA分子的大小，称取适量的琼脂糖粉末，放入锥形瓶，加适量1TAE电泳缓冲液;然后置微波炉内加热摇匀至完全溶化呈透明状，适当冷却后倒入胶托;胶完全冷凝后放入电泳槽，电泳槽里的缓冲液必须没过胶面。,.,7,.,8,2、点样！根据样品不同可分两种点样体系：A、样品+6XloadingbufferB、样品可直接点样（如ssp）最后记得点marker，并摆正胶的位置,.,9,点样,.,10,3、电泳！点完样后连接电源，设置好电源的参数，开始电泳。当溴酚兰的带（蓝色）的移动至一定长度即可停止电泳。电压要求：20V/CM胶，在样品出孔用低压（3V/CM，15min），然后调回标准电压，跑出的条带较好。,.,11,电泳槽,.,12,4、EB染色溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射EB-DNA复合物时，出现不同的效应。注意：严格区分污染区和非污染区，不把污染区的物品拿到非污染区，碰过EB的手套要及时丢弃！,.,13,EB染胶区,.,14,5、成像拍照Tanon-2500数码凝胶图像分析系统把图像摄录、处理、打印一体化。采用高分辨率CCD，高质量、高清晰度，保证摄录凝胶图像在低照度下的灵敏度、不掉失条带。,.,15,Tanon-2500数码凝胶图像分析系统,.,16,6、胶图分析以SBT-PCR为例，主要做A、B、DR三个位点，每个位点条带大小不同.,.,17,注意事项,注意事项,.,18,一、配胶,1.电子称的使用，要时刻注意保持电子称的精确性，保持清洁，根据不同的浓度的胶称琼脂糖。2.加TAE的量要适当，以免配出来的胶太薄导致胶孔太浅或浓度太低。3.倒胶前胶托一定要洗干净，并擦干；倒胶时要待胶冷到一定温度摇匀尽量不要产生气泡。若胶液的温度太高要顶在胶托防止胶托变形。,.,19,二、点样电泳,1.96孔塑料板要干净，loading要点均匀，控制在12ul的量，并做好对应标记。2.加样时，枪头要上紧，吸样均一准确，排液时吸头不要有残留。3.点完样后及时盖上胶垫，注意不要盖反。4.点电泳前最好检查待用胶是否合格；点电泳时要对准胶孔，尽量点完所有的样。5.点完样勿忘点marker并摆正胶位，电泳仪正负极不要插反，电泳槽的盖子要盖紧。,.,20,三、EB染色,1.切胶要准，取胶要稳，泡胶要慎，避免EB溅起。2.碰到EB的手套要及时丢弃。3.EB液要适时跟换，盘子要清洗。4.抹布要严格区分，不可交叉使用。,.,21,四、TanonTanon-2500数码凝胶图像分析仪的使用,1.使用前要注意清洁，以免影响胶图的清晰度。2.照胶时尽量减少开紫外灯的时间。3.拍照时先关摄像头再关紫外灯，不可颠倒，严格按照照