第五章 SEM样品制备技术NEW.ppt

第五章SEM样品制备技术,第一节SEM样品制备技术概述,一、生物样品按含水量分类1.含水量少的硬组织包括：毛发、牙齿、植物花粉、子粒等，昆虫的口器、刚毛、鳞毛、卵壳等处理过程：清洁表面粘胶喷金观察2.含水量多的软组织包括：动植物器官、组织及细菌、真菌等处理过程：取材固定脱水干燥喷金观察,1.使样品的表面形貌结构保持活体时的近似形态,所观察的表面要求处理干净。2.对拟研究内表面结构，可采用冷冻断裂技术获取一个新的观察面。3.尽可能在样品没变形的情况下除去水份，即对样品进行“无损干燥”。4.样品表面应有良好的导电性能和二次电子发射率。5.进行细胞化学研究时，要求标记物有一定的形态，以便于识别。,二样品制备的基本要求,三样品制备的一般流程,第二节样品制备的一般程序,一样品的前处理,二样品的干燥,四样品表面的导电处理,三样品装台（粘胶）,（一）、样品的前处理一般过程取材清洗固定脱水（二）、SEM与TEM在前处理中的区别1.样品大，一般6100mm2,高厚510mm,对于易卷曲的样品可固定在硬纸板或卡片纸上。2.特别注意表面清洁（生理盐水、缓冲液、5%苏打水、超声波震荡、酶消化）3.固定时间适当延长，除了戊二醛、锇酸、高锰酸钾外做固定液外，还有Paleace，Dalton固定液4.脱完水时要用进入中间液进行置换。,一样品的前处理,（三）思考题在TEM与SEM样品制备过程中，SEM制样在脱水后需要进行特殊干燥处理，而TEM超薄切片中脱水后无需干燥处理，分析其中原因。,从两方面考虑：1.样品块的大小不同。2.SEM与TEM成像机理及观察样品的特征区域不同。,二样品的干燥,（一）、空气干燥法（自然干燥法）1.基本描述将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥，也可直接(不脱水)放在干燥器中干燥。2.基本特点优点：简便易行、节省时间缺点：由于脱水剂挥发时表面张力的作用，组织块会而产生收缩变形,方法1：单固定或双固定脱水样品置于100的脱水剂中在空气中自然干燥；方法2：固定（组织导电处理）浸泡在缓冲液与乙醚的1：1中5min空气干燥；方法3：单固定或双固定乙醇脱水浸没于六甲基二硅胺烷HMDS中二次每次15min通风厨干燥1h,3.常用方法,（二）、临界点干燥法(CPD:criticalpointdryer),1.基本含义：临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。,2.基本特点优点：避免表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。操作较方便，快速23小时即可完成，常用缺点：需要特殊仪器设备-临界点干燥仪。,3.基本概念临界点：物质的气态和液态两相之间达到相同密度、成为均一流体时的温度和压力的总称。此时的温度称为临界点温度，压力称为临界点压力。中间剂：把用来置换脱水剂而后又被干燥剂所置换的液体。,5.常用中间剂：中间剂：把用来置换脱水剂而后又被干燥剂所置换的液体。试剂：醋酸（异）戊酯、丙酮6.干燥过程：固定脱水转入中间液移至样品室用液体CO2置换醋酸异戊酯CO2汽化排气干燥,7.CO2临界点干燥器工作原理,(1)脱水不彻底(2)醋酸异戊酯反流(3)样表粘有过多醋酸异戊酯(4)样品量过多(5)样品室温度高，注入CO2困难注入CO2量太少(6)样品室漏气,8.临界点干燥失败（不彻底）的原因,样品块过大。组织块几何空间中心位置的水份无法经脱水、中间剂置换、CO2置换等过程除去，CO2也无法完全置换掉中间剂，造成样品内外部由液CO2（占9597）、中间剂醋酸异戊酯23样品中心位置游离态水份12组成，在充分达到CO2临界态的4045，压力1011MPa时，样品几何中心位置游离态水由液体气化为水蒸汽时(液态醋酸异戊酯由液体气化为蒸汽时）有表面张力的存在，从而使样品有少量变形(2)CO2放入或排出时,样表压力骤增减(3)生物样品本身性质决定及临界点干燥本身的缺陷造成样品有少量变形,9.原因分析：经CO2临界点干燥之后的样品仍有少量变形的原因？,10.干冰优点(1)有利于微小样品的干燥(2)无需钢瓶，搬运方便(3)能准确放入足够的CO2量(4)夏天使用方便(5)不污染样品,玫瑰花瓣表面的SEM照片(850X)，CPD(criticalpointdryer)干燥,玫瑰花瓣表面的SEM照片(850X)，风干凝固,（三）、冰冻干燥,1.含水样品直接冷冻干燥常规步骤：取材固定冷冻保护处理快速冷冻升华（10-2乇）干燥装台镀膜基本特点：无需脱水，不会使样品收缩，较早使用的方法。但花费时间长，消耗液氮多，易产生冰晶损伤，未被广泛应用.,基本描述：将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程.,基本描述：样品用乙醇或丙酮脱水后过渡到某些易挥发的有机溶剂中，然后连同这些溶剂一起冷冻并在真空中升华而达到干燥。基本特点：优点：可减少冰晶损伤，且干燥时间短。缺点：有机溶剂对样品成分有抽提作用，造成部分内含物丢失。,2.样品脱水后的冷冻干燥,氟里昂TF冷冻干燥固定脱水置换(氟里昂取代酒精)冷冻干燥乙醇冷冻干燥法固定脱水冷冻干燥升温取样乙腈(acetonitrile)真空干燥法：基本描述：CH3CN，甲基氰，气化热很大，冷却后会固化、升华，利用乙腈在急速蒸发时会冷却固化的性质将样品干燥。一般流程：固定漂洗乙腈脱水渗透升华干燥,常用方法,氟里昂TF冷冻干燥,乙腈真空干燥法,（四）、从高熔点的有机材料中干燥,1.基本描述：选用高熔点的有机材料作为升华介质，既可以保留冷冻干燥的优点，又可以不对样品进行冷冻处理，无冷冻损伤，还简化操作。,、莰烯干燥法（1971Wattens.Buk）取材双固定清洗脱水置换(100苯脱脂、苯和环氧丙烷1:1、纯环氧丙烷每次15min)过渡(莰烯40-45和环氧丙烷1:1)加纯莰烯45，20min升华真空干燥装台镀膜观察,2.基本方法：,叔丁醇干燥法取材固定清洗乙醇脱水样品在100乙醇与叔丁醇的3：1、1：1、1：3、纯叔丁醇中各10min纯叔丁醇4凝固真空干燥镀膜观察,2.基本方法：,三样品装台(粘胶),（一）、导电胶适于：样品块大的组织块，能用较大的工具操作类型：银导电胶，碳导电胶（二）、双面胶带适于：细小颗粒（粉末、纤维、薄片）类型：碳双面胶带、铜、塑料片基,离子溅射（导电处理）的作用:1.防止样品损伤和荷电效应2.增加二次电子发射率，改善图像质量3.即排除原子序数效应的干扰。导电处理的一般方法：1.金属镀膜法2.组织导电法,四样品表面的导电处理,离子溅射镀膜法真空镀膜法,样品荷电效应说明图,Au,C,1.概念：采用特殊装置将电阻率小的金属(Au,Pt,Ag,Pd)离子溅射或真空蒸发后覆盖在样品表面的方法。2.作用：(1)消除荷电效应，提高二次电子发射率增加信噪比，提高图像反差;(2)提高样品表面的机械强度，增强样品耐受电子的轰击能力;(3)防止来自组织内部的信息参与成像。,（一）、金属镀膜法：,3.对金属膜的要求(1)膜的厚度要均匀,膜要薄,20nm左右(2)膜本身无结构，或结构很细微(3)二次电子发射率要高(4)耐电子束的轰击，化学稳定性好4.具体方法A.离子溅射镀膜法(1)离子溅射：在低真空中进行辉光放电时，阴极物质有飞散的现象。(2)离子溅射仪的作用：离子溅射（0.010.1Torr）离子蚀刻（要求高真空，高电压条件）,(3)离子溅射仪构造：真空部分:真空泵、真空钟罩、真空表、进气阀溅射部分：金属靶：溅射时做阴极,蚀刻时做阳极（金属:Au,Pt,Pd)样品台：溅射时阳极，蚀刻时阴极靶台距离调节器：控制部分：电压调节器、电流表、定时器，阳极阴极转换器,A.离子溅射镀膜法,(4)离子溅射仪工作原理放入样品抽真空加高压产生电场残余气体分子电离正粒子轰击金属靶激发金属颗粒金属颗粒依附于样品表面金属膜形成,A.离子溅射镀膜法,溅射出来的金属颗粒小,镀膜质地精细镀膜薄厚均匀膜片厚度容易控制,不掩盖样品表面结构,节省金属材料膜片附着力强受辐射热影响较小，对样品的损伤小。所需真空度低，节省时间金属粒子能够进入到样品表面的缝隙和凹陷处，对于表面凹凸不平的样品也能形成很好的金属膜,A.离子溅射镀膜法,（5）离子溅射镀膜的特点,(1)原理:高真空下,使某些金属物质加热到熔点以上,真空蒸发成极细的颗粒沉积到样品表面,在样表形成薄金属膜.(2)仪器:真空喷镀仪(10-5Torr),B.真空镀膜法,5.离子溅射法与真空镀膜法比较,1.定义：组织导电法:利用重金属盐溶液对生物体的蛋白质、脂肪及淀粉等成分的结合作用，使样品表面离子化或产生导电性能很好的金属化合物，从而提高样品耐受电子轰击的能力和导电率。2.导电液应具备的条件：(1)能对组织染色(2)组织结构保存完好(3)不污染样品(4)不掩盖样品超微结构(5)导电性能好，消除荷电效应(6)二次电子发射率高，亮度大,图像反差强,(二)、组织导电法(导电染色),3、常用处理方法(1)碘化钾-碘导电染色法：碘化钾20g+碘0.2g+双蒸水100ml2.5%戊二醛10ml+葡萄糖0.2g(2)碘化钾醋酸铅导电法A液：碘化钾20g碘0.2g,加双蒸水100mlB液：氢氧化钾4g醋酸铅1.2g加水至100ml用时需稀释，1分母液3分水,（3）.丹宁酸-锇酸导电法:,第三节特殊样品制备技术,一、直接观察法,二、活体观察法,六、样品的割断法,七、蚀刻法,八、铸型技术,三、粘贴镀膜观察法,四、熏蒸固定观察法,五、石蜡组织切片观察法,九、树脂包埋的样品SEM观察法,一、直接观察法,2.适用范围:适合于低倍条件下,观察含水量少的、表面有一定导电能力的、对分辨率要求不高的样品.,4.适用样品:植物干标本,干种籽,干果、果壳,竹木、骨骼、牙齿、蛋壳、土壤、岩石、金属等,3.基本步骤:取材风洗水洗后风干或不洗粘样常压或低压观察,1.基本描述:样品不经过任何处理,直接粘贴到样品托上入镜观察,二、活体观察法,1.基本描述：利用样品本身具有的导电和产生二次电子的能力，直接观察一些体积较小、含水分不多的活体昆虫或新鲜组织、器官的方法。其特点是：可观察生物活体形态结构和生活状态，图像表现真实，没有变形或人为附加结构。,2.基本要求：,限制昆虫的爬行和跳跃，用胶带限制其活动。样品体积尽可能小；低压观察常用25Kv，最大10Kv；操作熟练，迅速观察尽早摄影,3.基本步骤：取材清洗或不洗胶带粘样常压或低压观察,4.适用样品：螟、蛾、蚊、蚁、蜂、螨、线虫、被粘牢固的昆虫或其器官,三、粘贴镀膜观察法,1.基本描述：样品只进行粘贴、镀膜即可。其特点：常压观察下获得高分辨率高放大倍数图像。,2.适用范围:适宜观察表面细微结构丰富、含水量少的、形态比较固定或不宜进行脱水或干燥的样品。本方法解决了样品的导电率及二次电子发射量的问题，可以常压下观察高倍率、高分辨率图像,3.基本步骤：取材粘样镀碳（样品表面凹凸变化大的可先喷镀碳层）金属膜常压观察,4.适用样品:成熟的孢子、花粉，生活状态的菌体、菌落，尘埃、微小颗粒，丝绒、毛发，表面凹凸变化大的样品，如昆虫体表等。,四、熏蒸固定观察法,1.基本描述：粘贴后的样品放置于密闭容器中，用熏蒸法进行固定，经镀膜或不镀膜即可观察。其特点：该方法适合“不宜在液体中处理样品”，蒸汽固定剂为12的锇酸，全部操作在通风橱进行，高倍观察时还应离子溅射镀膜。,2.基本步骤:取材粘样熏蒸固定(10-30min)镀膜或不镀膜常压或低压观察,3.适用样品:固定培养基上的培养物，用于研究培养细胞的生长繁殖过程，菌落的自然状态、菌丝的生长，孢子的形成等。,五、石蜡组织切片观察法,1.基本描述：对动植物的石蜡切片进行适当处理，放在SEM下观察。其特点：图像分辨率高、景深大立体感强，制样简单、成本低、时间短。,2.基本步骤：光镜定位切片贴台脱蜡(二甲苯,3-5min后滤纸吸附溶解物，反复3-5次)镀膜(或不镀膜)观察,3.适用样品：一切组织的石蜡切片都适用，但对已经封固或加盖片的不能用。,六、样品的割断,（一）树脂割断法,1.环氧树脂冷冻割断法：取材修样(115mm)固定脱水包埋置换固化割断样品脱树脂临界点干燥装台粘胶,2.苯乙烯树脂割断法,特点:a.包埋的树脂已聚合,可长期保存b.割断时在室温下进行c.易割断较硬的组织(骨骼,结缔组织)步骤：取材固定脱水置换包埋聚合割断脱树脂醋酸异戊酯置换临界点干燥装台粘胶,1.无水乙醇冷冻割断法:优点:制作时间短,不易弄脏容器步骤:取材固定脱水100%乙醇包埋冰冻固化冷冻裂断融化乙醇临界点干燥装台粘胶2.70%乙醇冷冻干燥特点:经济简单,但不能人为确定断裂面步骤:准备冷冻自然断裂冷冻干燥装台喷金,(二)有机溶媒割断法,方法:(1)刀切(2)镊子掰开(3)双面胶带法(4)液氮冷冻割断,(三)干燥样品的割断,七、蚀刻法,1.酶蚀刻法利用酶的作用使细胞的一部分物质被蚀刻去掉,从而清楚的显示出另外一部分结构。,如：利用链霉蛋白酶(prorase)处理小麦的胚乳细胞，把包在外面的细胞去掉，以观察淀粉的结构。,2.离子蚀刻法使用离子溅射仪进行辉光放电时，用高速的阳离子冲击样品表面，剥离掉样品的成分，暴露样品内部细微结构。,如：用该方法可以看到白细胞、胰脏外分泌细胞的核表面结构，清楚看到核孔的分布状况。,八、铸型技术1.概念：为了研究空腔脏器特别是血管系统复杂的立体分布，先向腔内注射某种成形物质，待该物硬化后再把组织腐蚀去掉，剩下的成形物即能显示血管系统的立体分布，这种技术称铸型技术。2.常用的铸型剂：甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一种树脂，为丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，是理想的铸型剂。,3.用ABS制作血管铸型样品的一般步骤,灌流和注入铸型剂腐蚀和清洗显微解剖和剥制铸型干燥和镀膜,九、环氧树脂包埋的样品SEM观察法,1.基本描述：环氧树脂包埋的样品切成半薄切片或超薄切片后，再将环氧树脂除去，在SEM下观察研究，可以对样品的细胞结构进行多种综合研究，得到更多的信息。,2.常用溶剂：氢氧化钠饱和乙醇（或醚类、丙酮）容易可以溶解已经聚合的环氧树脂，将NaOH溶解于乙醇，饱和（24），放置23天，在此过程中产生氧自由基，溶液颜色由浅褐色变成金棕色，氧自由基可以打断环氧树脂和酸酐间的酯连接，溶解环氧树脂。也可用NaOH的冠醚溶液。,3.操作步骤：,解剖镜下除去环氧树脂中不感兴趣的部分。将组织块（或切片）放入合适的容器中，其中加入溶解液NaOH的乙醇溶液510ml,1-4h样品取出放入绝对乙醇(