高级生物化学-蛋白质2.ppt

第五节蛋白质的理化性质,与分离纯化,一、蛋白质的变性与复性,蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,1.蛋白质变性的概念,2.变性的本质,次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不涉及一级结构的破坏,Denaturation,3、变性理论1931年，我国生物化学前辈吴宪提出了“蛋白质变性后，其肽链由原来紧密有序的构象变成了松散无序的构象”。这就是变性作用，并且认为天然蛋白质的紧密构造及晶体结构是由分子中的次级键互相联系而形成的，所以容易被物理的和化学因素所破坏，这个观点反映了蛋白质变性本质。,4.变性的因素物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。（如十二烷基硫酸钠即SDS、尿素、盐酸胍）,变性理论和变性的因素,变性的因素作用机理,清洁剂,丙醇,丙酮,凝结,使纠缠,常用的变性剂：尿素,尿素：与多肽主链竞争氢键；增加非极性侧链在水中的溶解度，从而降低疏水相互作用。,尿素或者胍,变性剂：十二烷基硫酸钠（SDS）,5、变性蛋白质的特性,生物活性丧失或者降低，如：Hb变性不能输送O2,酶变性失去催化作用。物性理质改变，如：溶解度降低，粘度升高，失去结晶能力，旋光值改变。(分子量不变）光吸收？化学性质改变，如：蛋白质变性时，有些原来在分子内部包藏而不易与化学试剂起反应的侧链活性基团，由于结构的伸展松散而暴露，易与化学试剂反应。生物化学性质改变：蛋白质变性后，分子结构伸展松散，易为蛋白质水解酶所分解。变性具有协同性，部分变性是可逆的,化学键改变：非共价键破坏（构象改变）肽键不变（构型不变分子量不变）二硫键？,有底物存在会抑制变性？二硫键多蛋白质难变性胶原蛋白有特殊共价键纯化一个耐热稳定的酶是否需要低温处理？酶敏感性的概念？,蛋白质变性,6、应用举例,临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。误服重金属解毒方式?长期从事重金属作业的人吃高含蛋白质类食物？,思考,核酸的变性,(一)、DNA的变性(denaturation),1定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。2方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等3变性后其它理化性质变化：,OD260增高粘度下降比旋度下降浮力密度升高酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,DNA的变性是爆发式的,增色效应,增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础，但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。变性DNA的双链解开，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故产生增色效应。不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性后，其260nm的光密度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围多在2030%之间。,假定一个DNA大分子最初全部是双螺旋结构，在热变性后A260nm上升30%以上,DNA和蛋白质变性的比较,DNA降解：指多聚核苷酸中的磷酸二酯键断裂，使分子量下降，其过程不可逆。DNA变性：空间结构遭到破坏，一级结构完好共价键完好，一般是可逆的。,4、DNA的熔解温度（Tm）：,Tm,DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。,DNA的熔解温度（Tm）：,（1）定义：DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。DNA的Tm一般在8295之间（2）影响DNA熔解温度Tm值的因素:DNA均一性：G-C含量：G-C含量与Tm值成正比。介质中离子强度：,1、概念:若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)这种变性也称为可逆变性。2、方法：透析或超滤除去变性剂，或稀释3、举例：,有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。,7、蛋白质的复性,牛胰核糖核酸酶变性和复性,1DNA复性(renaturation)的定义在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。2DNA复性后的理化性质变化,减色效应:DNA复性时，其溶液OD260降低,DNA的复性,粘度上升浮力密度降低生物活性部分恢复,热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。,序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢离子强度有利于复性DNA浓度复性复性速度与DNA的浓度成正比环状DNA易复性,一般认为比Tm低25左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢,影响复性的因素,复性速度可用Cot衡量,Cot1/2值：（1）概念：当C/CO/2时的Cot值定义为Cot1/2值，Cot1/2/，即复性一半时的Cot值.（2）影响Cot1/2值的因素：不同的DNA的Cot1/2值是不同的与值有关；而且DNA分子序列的复杂性影响值DNA分子序列的复杂性（值）：(1)定义为：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值如（ATATAT）,其值为,（ATGC）（ATGC）的值为(2)值与Cot1/2值的关系，=Cot1/2Cot1/2是与基因组的大小成正比的,Cot1/2表明基因组所包含不同序列的总长度,复性的Cot1/2与其复杂度成正比。任何DNA的复杂度可以通过与复杂度已知的DNACot1/2比较得出。通常以大肠杆菌DNA作为标准。假设4.2106bp大肠杆菌基因组由不同序列组成,（1）阳离子可以中和DNA中所带负电荷的磷酸基团，减弱DNA链间的静电作用，促进两条互补的多核苷酸的相互靠近，从而促进DNA的复性。（2）温度升高可使DNA变性，因此温度降低到熔点以下可以促进DNA的复性。（3）DNA链的浓度增加可以加快互补链随机碰撞的速度，从而促进DNA的复性。,试述下列因素如何影响DNA的复性过程。(1)阳离子的存在(2)低于Tm的温度(3)高浓度的DNA链,思考,在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢可以通过哪些法来检测？(1)减色效应(hpochromiceffcef)测定光密度,即OD值(opticaldensity),DNA从单链变成双链，OD260减少30%(2)羟基磷灰石柱层析羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢,不易吸附单链,思考,蛋白质变性后，其性质有哪些变化？（9分）厦门大学2005年生物化学考研试题厦2.蛋白质变性主要由于氢键的破坏这一概念是由Anfinsen提出来的（是非题-）复旦大学2000年3.蛋白质变性的实质是非共价键断裂，天然构象解体，但共价键未发生断裂。（是非题-）中国科学院06年4.1所有变性蛋白质都可以复性。（是非题-）4.2核酸变性后对紫外光的吸收能力增强。（是非题+）4.3核酸热变性有何特点？Tm值和Cot值分别表示什么？各有何应用价值？华东师范大学2006年,思考题,江苏大学2004年硕士研究生入学考试生物化学试卷5.1核酸变性或降解时，出现减色效应。（是非题-）5.2结晶蛋白质都是变性蛋白质。（是非题-）5.3盐析法可使蛋白质沉淀，但不引起变性，所以常用于蛋白质的分离和纯化。（是非题+）5.4蛋白质的变性是蛋白质分子立体结构的破坏，因此常涉及肽键的断裂。（是非题-）5.5变性DNA的复性与、等有关。,思考题,6下列关于蛋白质变性的叙述，哪项是错误的?A生物活性降低或丧失B蛋白质空间构象破坏C280nm光吸收反应增强D溶解度增加E易被蛋白酶水解江苏大学医学院2005年医学生物化学（硕士）7.双链DNA分子中GC含量越高，Tm值就越大（）复旦大学2000年8.DNA的Tm值A.只与DNA链的长短有直接关系B.与GC碱基对的含量成正比C.与AT碱基对的含量成正比D.与碱基组成无关E.所有真核生物Tm都一样湛江海洋大学2003年,思考题,（一）蛋白质的两性电离蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,在蛋白质分子中，游离的NH2和COOH相距较远，静电引力减弱，故：a末端的NH2的pK值减少b末端的COOH的pK值增大,二、蛋白质的理化性质,蛋白质的等电点,(isoelectricpoint,pI),当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。,pH=pI时，蛋白质净电荷为零，蛋白质分子在电场中不移动pHpI时，蛋白质净电荷为负，蛋白质分子在电场中向阳极移动pHpI时，蛋白质净电荷为正，蛋白质分子在电场中向阴极移动在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用。所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。,溶液中蛋白质颗粒,思考题,1处于等电点的蛋白质（）a.分子不带电荷b.分子最不稳定,易变性c.分子带的电荷最多d.易聚合成多聚体e.易被蛋白酶水解2将蛋白质溶液的PH值调节到其等电点时（）a.可使蛋白质稳定性增加b.可使蛋白质表面的净电荷不变c.可使蛋白质表面的净电荷增加d.可使蛋白质胶体溶液稳定性降低，易于沉淀。e.对蛋白质表面水化膜无影响,思考题,中国科学院2002年研究生入学试题（判断）3.1酶的最适pH与酶的等电点是两个不同的概念,但两者之间有相关性,两个数值通常比较接近或相同.3.2蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的数目比例有关3.3蛋白质在处于等电点时的溶解度A.最小;B.最大;C.与等电点没有关系.4.1溶液的pH可以影响氨基酸的等电点（判断）.南京大学20005、在某一溶液中含有三种蛋白质，其性质如下a相对分子质量40000等电点8.5b400005.9c600005.9设计一个方案纯化这三种蛋白。苏州大学2005,思考题,2、蛋白质的等离子点（特征常数）,蛋白质的等电点在有中性盐存在下可以发生明显的变化，原因是蛋白质分子中某些解离基团与中性盐中的离子相结合。蛋白质的等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。等离子点（isoionicpoint）：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点(蛋白质的等离子点：指在纯水中（即没有其它盐类存在）蛋白质的正离子数等于负离子数的pH值。),（二）、蛋白质的胶体性质,1.蛋白质溶液稳定的因素：蛋白质分子大小属于胶体质点范围（1）水化层：分子表面上亲水基团在水溶液中能与水分子起水化作用（2）双电层（电荷）：分子表面上的可解离基团，在适当的pH条件下，都带有相同的电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。,2、蛋白质的沉淀,（1）概念：蛋白质分子发生凝聚，从溶液中析出的现象。（2）原理：破坏稳定因素：水化膜和双电层,（3）沉淀方法：,盐析法有机溶剂沉淀重金属盐沉淀条件:pHpI(Pr-M+)某些酸类沉淀条件：pHpI(Pr+X-)抗体对抗原蛋白质的沉淀等点的沉淀,盐析法,定义：加高浓度中性盐使蛋白质沉淀析出的现象。常用的中性盐主要有硫酸铵，优点是温度系数小而溶解度大（另外：NaCl、NaSO4等）。原理：破坏蛋白质胶体周围的水化膜，中和了蛋白质分子的电荷，使蛋白质沉淀而析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。,蛋白质不变性,温度;pH值;蛋白质浓度,影响盐析的因素有：,盐析法-实例分析,血清中加硫酸铵至50%饱和度，则球蛋白先析出；继续加入硫酸铵至饱和，则清蛋白沉淀析出。微生物发酵生产酶制剂就是采用盐析的作用原理，从发酵中把目的酶分离提取。,有机溶剂沉淀,有机溶剂（和水互溶）乙醇、丙酮等。原理：有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因是（1）加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低，因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。（2）有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀。,低温蛋白质不变性,有机溶剂沉淀蛋白质时，介电常数的增加使离子间的静电作用的减弱而致（判断）,复旦大学2002年,有机溶剂沉淀,pH=pI时，可加速蛋白质沉淀。低温（04）。,低温蛋白质不变性,有机溶剂沉淀注意事项,有机溶剂长时间作用于蛋白质会引起变性，操作时需注意：（1）低温操作：提取液和有机溶剂都需事先冷却。向提取液中加入有机溶剂时，要边加边搅拌，防止局部过热，引起变性。（2）有机溶剂与蛋白质接触时间不能过长，在沉淀完全的前提下，时间越短越好，要及时分离沉淀，除去有机溶剂。实例分析：食品级的酶制剂的生产，中草药注射液、胰岛素的制备大都用有机溶剂分离沉淀蛋白质。有机溶剂的添加量最好不超过沉淀目的酶所必要的数量，多加有机溶剂会使更多的色素、糊精及其它杂质沉淀。,重金属盐沉淀,氯化高汞、硝酸银、醋酸铅、三氯化铁等。,蛋白质变性,反应条件:pH7的蛋白质(先用pH值低于7的缓冲液处理)阴离子交换剂适合分离PIcdb。,思考题,分析：Sephadex是葡聚糖凝胶，它是具有不同交联度的网状结构，其颗粒内部的孔径大小可以通过控制交联剂与葡聚糖的比例来达到因此它具有筛分效应用它作为填充料制成层析柱，可以根据被分离物质的大小进行分离。已有不同型号的葡聚糖凝胶用于不同物质的分离。当蛋白质混合样品随洗脱液向下流动时，比凝胶颗粒孔径大的蛋白质分子不能进入凝胶网格内，被排阻在凝胶颗粒的外部；比凝胶颗粒孔径小的蛋白质分子则能进入到网格内部。其结果是，分子大的蛋白质则随着洗脱液直接从柱上流出，分子比较小的蛋白质则因走了许多弯路”而被后洗脱下来。分子愈小，“弯路”走得愈多，洗出的速度愈慢。根据这一原则，上述蛋白质混合物从SephadexG50洗脱出的顺序是：bcad。,思考题,4、一种分子量为24,000、pI为5.5的酶被一种分子量类似、但pI为7.0的蛋白质和另外一种分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质污染。提出一种纯化该酶的方案。答：用凝胶过滤(即分子排阻层析)法先除去分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质，余留下来的低分子量的含酶的混合物再用离子交换层析法分离，于是就能获得所需要的纯酶。,思考题,5、一个研究者分离了寡聚肽不知道序列也不知道氨基酸组成。企图用Edman降解测序列的努力均失败；反应不能进行。推测该问题的两种完全不同的解释。提出至少能够区分这两种可能的实验。答：N-末端被封闭（如乙酰化）或者多肽是环状。如果肽不是环状，应该有。可以用羧基肽酶A攻击。如果肽是环状的，应该找到某些蛋白酶切割一次，出现N-末端。,思考题,6、某些多肽序列中正好每隔7个残基有一个Leu残基的重复则显示形成反平行卷曲的螺旋结构二聚体化倾向。多肽的-螺旋一般是由3.6残基/转卷曲的，试述二聚体化的机制。在这样卷曲的螺旋中残基/转值将会是多少？答：如果螺旋弯曲而使残基/转数值变为3.5，则每2次旋转使Leu残基突出在同一侧面，这样两个多肽链上的Leu残基提供相互作用的疏水型表面。这种结构称为亮氨酸拉链。,思考题,思考题,8一种蛋白质按其重量含有1.65%亮氨酸和2.48%异亮氨酸，计算该蛋白质的最低相对分子质量。9某蛋白质多肽链有一些区段为-螺旋构象，另一些区段为-折叠构象，该蛋白质相对分子质量为240000，多肽外形总长为5.0610-5cm，计算多肽链中-螺旋构象占分子长度的百分之多少？10计算一个含有78个氨基酸残基的多肽，若呈-螺旋状态，其长度为多少nm，若呈-折叠结构长度为多少nm？,思考题,8解：亮氨酸和异亮氨酸的相对分子质量都是131，根据两种氨基酸的含量来看，异亮氨酸亮氨=2.48%1.65%=1.51=32。所以在此蛋白质中的亮氨酸至少有2个，异亮氨酸至少有3个，那么：1.65%=1(131-18)/蛋白质Mr蛋白质Mr=226/1.65%=12697。答：此蛋白质最低相对分子质量的12697。9解：一般来讲氨基酸的平均相对分子质量为120，此蛋白质的相对分子质量为240000，所以氨基酸残基数为240000/120=2000个。设有X个氨基酸残基呈-螺旋结构，则：X0.15+（2000-X）0.36=5.0610-5107=506（nm）计算后，X=1019；-螺旋的长度为10190.15=152.9（nm）答：-螺旋占蛋白质分子的百分比为：152.9/506=30.22%10解：呈-螺旋状态时：780.15=11.7（nm）呈-折叠状态时：780.36=28.1（nm）,思考题,解：（1）Val、Pro、Phe和Ile是非极性氨基酸，它们的侧链一般位于分子的内部。Asp、Lys和His是极性氨基酸，它们的侧链一般位于分子的表面。（2）Ser、Thr、Asn和Gln在生理pH条件下有不带电荷的极性侧链，它们能参与内部氢键的形成，氢键中和了它们的极性，所以它们能位于球状蛋白质分子的内部,11（1）球状蛋白质在pH7的水溶液中折叠成一定空间结构。这时通常非极性氨基酸残基侧链位于分子内部形成疏水核，极性氨基酸残基位于分子表面形成亲水面。（2）Ser、Thr、Asn和Gln虽然是极性氨基酸，但它们常常位于球状蛋白质的分子内部，为什么？,思考题,12、简述血红蛋白结构与功能的关系？,解：蛋白质是功能性大分子。每一种蛋白质都有特定的一级结构和空间结构，这些特定的结构是蛋白质行使蛋白质功能的物质基础，蛋白质的各种功能又是其结构的表现。蛋白质的任何功能都是通过其肽链上各种氨基酸残基的不同功能基团来实现的，所以蛋白质的一级结构一旦确定，蛋白质的可能功能也就确定了。如血红蛋白的-链中的N末端第六位上的谷氨酸被缬氨酸取代，就会产生镰刀形红细胞贫血症，使红蛋白的亚基本身具有