分子生物学Chapter 3 DNA 复制PPT课件

.,Chapter3DNA复制（Replication）,3.1DNA复制的起点和方向,.,3.1.1DNA复制的方向,通过实验判断DNA复制的方向,实验证实E.coliDNA双向复制,对不同复制模式的预期结果,实际观测结果,E.coliDNA的复制是双向的,.,3.1.2复制起点和方向的模式,.,复制起点的分离,.,3.1.4复制起点的结构特征,E.coli的复制起点OriC与其它细菌的复制起点的序列比较,.,以E.coli的复制起点OriC为例是染色体上位置固定的一段DNA富含AT含甲基化位点：GATC重复序列13bpDR(DirectionalRepeat:同向/直接重复)9bpIR(InvertedRepeat:反向重复)复制起点的这些特征有利于在该位点快速解链以发动复制和促进DNA聚合酶的结合。,复制起点的结构特征,.,3.1.5DNA复制的引物是RNA-证实实验之1,.,3.1.5DNA复制的引物是RNA-证实实验之2,用32P标记复制引物,复制，合成冈崎片段,DNase酶切,.,复制引物,前导链合成的引物：由RNA聚合酶引导合成的RNA（证据：实验之1）（见复制的转录激活）后随链合成的引物（冈崎片段合成的引物）：由引物酶催化合成的RNA。引物酶不同于转录中的RNA聚合酶。引物酶由dnaG基因编码。引物在完成冈崎片段合成后被降解。冈崎片段之间的缺口有DNA聚合酶和DNA连接酶通过缺口平移的方式填补。,.,引物的去除和冈崎片段的连接,3,5,OH,OH,.,复制的转录激活,.,3.1.6复制的过程,起始：引发体的形成延伸：复制体形成以及单脱氧核糖核苷酸的添加导致新链的延长终止：子代双链分子的分离,.,引发前体Preprimosome,起始：引发体的形成,E.coliDNA,.,.,复制体的形成和新链的延伸,.,复制的终止和子代分子的分离,终止：Tus蛋白+终止陷阱子代分离：拓扑异构酶IV；XerCD蛋白（位点特异的重组酶）,.,3.2复制的模式,.,复制（model）滚环复制（Rolling-circlereplication）D-环复制（Displacement-loopmodel）,.,3.2.1新起始复制方式（denovainitiation）,注：红色线条表示反射性同位素标记的新链，经过放射自显影后可在感光胶片上显示出来。,Cairns,J.P.:ColdSpringHarborSymposiaonQuantitativeBiology28:44,1963.,3H,B,A,C,3H,复制/凯恩斯模型（model/Cairnsmodel）,.,新起始方式的主要特征,每次复制均从一个固定的复制起点起始前导链连续合成，后随链由冈崎片段连接而成,SV40的复制,真核生物DNA的复制,.,3.2.2滚环复制Rolling-circleModel,.,前导链,滞后链,.,.,滚环复制的特征,复制起始时，复制起点的一条单链断裂，而释放出5端和3端。3端作为前导链合成的引物，前导链连续合成。5端游离出来，作为后随链合成的模板。在旺盛合成时期，前导链不断合成，且连在一起形成多联体分支，并作为新的后随链合成的模板。前导链的合成不需要另外合成的RNA引物。,.,3.2.3D-环复制（D-loopModel）,（线粒体DNA）,.,D-环复制的特征,环状DNA模板的两条单链的复制起点位置不同且相距甚远。复制起始首先在一条单链的复制起点起始，单向、连续合成前导链，并置换另一条模板单链。当另一条单链的复制起点暴露后，起始后随链的单向、连续的合成。两条链的复制完成有先后。,.,3种复制方式的主要差异,.,3.3避免线性DNA复制时末端缩短的机制,.,环状DNA的复制不存在末端缩短的问题,.,3,突出末端,缺口,5,缺口,线性DNA复制后出现5末端缩短,.,T7噬菌体通过形成共联体避免5末端缩短,冗余末端,冗余末端,RNase切点,RNase切点,RNase错位切割,共联体,.,腺病毒-2：末端起始复制,SSB：单链结合蛋白TP：末端结合蛋白,pTP：末端结合蛋白前体,.,腺病毒-2：单链置换式复制,红色单链的复制起始,蓝色单链复制起始,.,真核生物避免末端缩短的机制,.,现象：1930s,果蝇和玉米中，染色体末端缺失时，会出现两个姊妹染色体在末端融合；而在正常染色体中不会发生末端的融合。1938，Muller推测染色体末端存在一种特殊结构，对未出染色体的稳定性由重要作用即后来称为“端粒”的结构。1984，Blackburn,E.研究组发现四膜虫rDNA末端在小核阶段没有重复片段，但在发育成大核后rDNA末端出现了370520bp的（GGGGTT）n的重复序列。-推测在发育过程中添加了此重复序列。该推测通过加尾实验验证。,端粒的发现和证实,.,加尾实验1984，Shampay，J&Blackburn,E,自主复制序列,结论：四膜虫rDNA染色体末端的确可以在发育中延长,.,加尾实验（续）,结论：不管染色体末端的来源何在，其延长部分的序列由宿主细胞决定。这暗示细胞内具有特殊的结构和机制来控制染色体末端的延长。,.,加尾实验（续）,通过在酵母中的加尾实验证明：染色体末端在复制过程中可以被延长。延长的末端序列由宿主酵母决定，即细胞中有特殊的结构或机制控制末端的延长。进一步的加尾实验：四膜虫末端重复在体外的四膜虫细胞提取液中进行加尾实验酵母的末端重复在体外的四膜虫细胞提取液中进行加尾实验两个实验的结果：均出现加尾，且延长的尾巴与四膜虫的染色体末端重复一致。但是，四膜虫末端重复的互补序列在上述体系中不能加尾。,末端的延长是DNA合成过程，原有的序列是合成的引物而不是模板。,.,端粒和端粒酶：大多数真核生物,端粒（Telomere）：真核生物中由染色体末端的短重复序列和相关蛋白质组成的特殊结构，对维持染色体的稳定性起着重要作用。端粒酶（端粒末端转移酶Telomereterminaltransferase）:真核生物特有的维持端粒完整性的酶，含有特定的小分子RNA分子。,通过端粒复制避免末端缩短,.,.,当端粒酶催化合成足够长的G链后，G链回折形成Hoogsteen结构，且末端和另一链的末端连接，形成封闭的染色体末端。,G链,.,端粒长度与细胞“年龄”相关,.,3.4真核生物和原核生物复制的特征和复制调控,.,3.4.1原核生物的复制特征,单复制子营养充足时，可在一个复制子内起始多次复制。,第一次复制的复制叉,第二次复制的复制叉,.,3.4.2真核生物复制的特征,多复制起点和多复制子复制的不一致性同一个细胞中不同复制子起始复制的早晚差异不同组织细胞复制的早晚差异复制子的数量和复制速度随着细胞、组织和发育时期不同而有差异只有当所有的复制子完成复制后，才能在起始点上起始下一次的复制；而且，真核生物的复制严格控制在S期，一次分裂复制一次。端粒酶：避免染色体末端缩短的机制,.,3.4.3复制的调控主要是对复制起始的控制,原核生物：甲基化对复制的调控：ColE1质粒：反义RNA对复制的负调控真核生物：正调控负调控,.,GATC,CTAG,第一次复制,GATC,CTAG,半甲基化OriC,全甲基化OriC,GATC,CTAG,CH3,Dam甲基化酶,起始第二次复制,全甲基化OriC,甲基化对复制的控制：Dam甲基化酶对GATC位点的甲基化DnaA蛋白-识别全甲基化的复制起点,.,质粒ColE：反义RNA对复制的调控,引物前体500nt,RNaseH:降解