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文档简介

,第二部分,RT-PCR的原理，方法及琼脂糖凝胶电泳结果分析,RT-PCR技术背景,（1）基因的表达,（2）PCR技术,变性退火延伸,（3）逆转录酶和RT-PCR,RT-PCR技术目的,通过反转录(reversetranscription，RT)和聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)的方法，检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度,RT-PCR实验原理,m-RNA,c-DNA,PCR产物,RT(反转录),PCR,这里修改标题,RT-PCR实验原理,RT-PCR实验步骤提取总RNA,TRIzol法抽提总RNA1、细胞1107或组织100mg,加1mlTRIzol(细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底，后转至EP管）颠倒混匀10下，室温5分钟。2、氯仿1/5体积（0.2ml），颠倒混匀10下，室温5分钟。3、4，离心12000g，15分钟。4、转上层水相（约400l）于另一1.5mlEP管中，加等体积异丙醇（约400l），混匀室温10分钟。5、4，离心12000g，10分钟。6、弃上清，加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml。7、4离心7500g，5分钟。8、弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥），溶于DEPC水中至20l（可在55-60水中，10分钟助溶）。9、紫外分光光度计测总RNA浓度。,RT-PCR实验步骤反转录（RT）,逆转录反应：1、RNA1-5g,加入适量的DEPC水至11lOligo(dT)151l混匀，离心，7010min。2、立即冰水浴。10XPCRbuffer2l25mMMgCl22l10mMdNTPmix1l0.1MDTT2L混匀，离心，4250min。3、9510min（破坏MLV,终止反应），4保存。,RT-PCR实验步骤聚合酶链反应(PCR),PCR反应：反应体系：总体积20l(50l)试剂浓度体积TaqBuffer10(5l_)dNTP10mM(0.5l)上游引物10pmol/l(1l)下游引物10pmol/l(1l)cDNA模板(1-10l)Taq酶2.5U/l(1l)DEPC水20l-4.3l混匀28-36循环，4保温,RT-PCR实验步骤琼脂糖凝胶电泳,加1-10lPCR产物与上样缓冲液（1-2.5l）混匀，加样，电泳。成像系统进行成像分析。,琼脂糖凝胶电泳结果分析,DNA分子中含有磷酸基和碱基，在生理条件下，磷酸基中的羟基发生解离，因此DN
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