《RNA的加功与修饰》PPT课件.ppt

第8章RNA的加工与修饰,1)mRNA加帽的生物学功能2)mRNA加尾的生物学功能3)mRNA前体的可变剪接4)RNA的修饰与编辑5)mRNA的转移6)mRNA的降解,细胞中RNA的组成,PolI,PolII和PolII类基因中的非编码RNA,1)PolI:rRNA,28SRNA,5.8SRNA,18SRNA2)PolII:URNA,miRNA,siRNA3)PolIII:5SRNA,tRNA,7SLRNA,原核生物极少转录后加工,1)原核生物mRNA缺少加帽和加尾;2)原核生物mRNA没有内含子,不存在剪接加工;3)未发现原核生物mRNA存在编辑的例子;4)原核生物无终止密码mRNA的翻译延伸.,tmRNA的工作机制,NostopcodonmRNA的翻译.,真核生物RNA的加工与修饰,RNA的加功与修饰,未端修饰（end-modification）加帽与加尾.真核生物和古细菌的mRNA合成时，需在5-端加帽及3-端加上一段Poly(A)尾巴。剪接（splicing）内含子切除,真核生物中大多数编码蛋白质的基因都有内含子，这是一段不编码的顺序，在转录时与编码顺序一道拷贝成前体RNA。前体RNA中的内含子剪除后转为成熟的mRNA，然后翻译成蛋白质。某些古细菌的转录物也有内含子，但在真细菌中非常罕见。剪切原核生物和真核生物的rRNA和tRNA初级转录物常由多个功能单位组成，必须剪切后才能转变为成熟的分子。化学修饰所有生物的rRNA和tRNA都必须进行化学修饰，将某些化学基团加入到每个RNA分子中。编辑通过化学修饰改变mRNA的编码信息称为RNA编辑，仅在某些生物种属和细胞器基因组中存在。,线粒体RNA和叶绿体RNA的加工与修饰,1)不加帽2)不加尾3)有内含子,自我剪接4)广泛的编辑5)广泛的修饰,mRNA加帽的功能(1),在所有转录的RNA产物中,只有POLII基因转录产物才有帽子结构,其功能是:1）阻止mRNA的降解细胞内存在许多RNA酶（RNase），它们可攻击游离的RNA分子。RNA酶的降解从5端起始，当在mRNA的5端加上m7GpppG帽子后，带有3个连接磷酸的5帽可阻止RNase切割。2）提高翻译效率真核生物mRNA必须通过5帽结合蛋白才能接触核糖体,起始翻译。缺少加帽的mRNA由于不能被5帽结合蛋白识别，其翻译效率比加帽mRNA低二十倍。,mRNA加帽的功能(2),3）作为进出细胞核的识别标记凡由PolII转录的RNA均在5端加帽，包括snRNA，这是RNA分子进出细胞核的识别标记。大多数snRNA转录后在细胞核中接收5端单甲基m7G加帽，然后转移到细胞质与snRNP蛋白结合。在细胞质中snRNA5帽需再修饰成为三甲基带帽结构m2，2，7G，随后重新返回细胞核参与mRNA的剪接加工。U6snRNA由PolIII转录，在其5端保留的三磷酸基团无帽子结构，因而不能输出细胞核。某些突变型的被输送到细胞质中的snRNA由于不能合成三甲基带帽结构，不能返回细胞核。4）提高mRNA的剪接效率5帽结合蛋白涉及第一个内含子剪接复合物的形成，直接影响mRNA的剪接效率。,加帽可保护mRNA,RNA进出细胞核,mRNA的帽子结构是进出细胞核的识别标记,未加帽的mRNA不能输出细胞核.核膜通道具识别其蛋白质成分,mRNA3加尾,mRNA加尾的作用,1）提高mRNA的稳定性2）控制与提高mRNA翻译效率3）有助于mRNA前体最后一个内含子的剪切,poly(A)有助于mRNA的稳定,U1A蛋白合成的自我调节:UIAmRMA的5有UIA蛋白结合顺序.当UIA蛋白过剩时,UIA与前体mRNA5结合,导致3切割因子与AUUAAA位点结合,阻止加尾,并引起mRNA前体降解.U1A蛋白质:U1snRNPs中与U1snRNA结合的蛋白质,与mRNA剪接加工有关.,poly（A）提高翻译效率,Poly(A)与翻译起始有关,eIF4:eIF4E,4A,4G,Poly(A)可调控翻译起始,许多动物卵细胞的成熟依赖于母源mRNA的加尾.一些母源mRNA的Poly(A)尾太短,不能起始翻译.原因是加尾蛋白CPSF在Maskin的作用下不与加尾信号结合.孕激素可作用CPEB磷酸化,减弱Maskin的作用,促使CPSF与加尾信号结合,Poly(A)延伸,翻译进行.,mRNA前体的剪接,1)mRNA前体的剪接步骤2)mRNA前体中与剪接有关的顺序3)mRNA前体剪接中的转脂反应4)snRNA在mRNA前体剪接中的作用5)SR蛋白质在mRNA前体剪接中的作用6)可变剪接7)反式剪接,mRNA两步剪接两次转脂事件,前体mRNA剪接相关顺序,前体mRNA剪接中的两次转脂反应,mRNA的剪接过程,snRNA在前体mRNA剪接中的作用,内含子的种类与分布,内含子类型分布-GUAU内含子真核生物核前体mRNAAUAC内含子真核生物核前体mRNAI型（GroupI）真核生物核前体mRNA细胞器RNAII型（GroupII）细胞器RNA某些原核生物RNAIII型（GroupIII）细胞器RNA孪生内含子（Twintrons）细胞器RNA前体tRNA内含子真核生物核前体tRNA古细菌内含子不同RNA-,组群I内含子(GroupI)核酶,这是最早在单细胞原生生物的rRNA剪切加工中发现的内含子切除现象,不依赖蛋白质仅由rRNA分子自身催化的剪接反应,又称为核酶.,组群II内含子(GroupII),组群II内含子(GroupII)主要出现在线粒体和叶绿体mRNA前体剪接中.GroupII内含子剪接也不依赖蛋白质,主要由前体mRNA的构型提供剪接活性,也属于一类核酶.GroupII的内含子二级结构与UsnRNA的类似,因此推测后者由GroupII型进化而来,UsnRNA提供了与前者类似的空间结构.,前体mRNA的可变剪接,果蝇的性别发育与基因调控,TheX:Asignalandthecontrolofsexdetermination,sexualbehavior,anddosagecompensation.TheX:AsignaltargetstheSxlgene,controllingitsexpression.AutoregulationofSxlisestablishedonlyinembryoswhosechromosomalconstitutionis2X:2A(twoXchromosomes;twosetsofautosomes),butnotinX(Y):2A(oneXchromosome;twosetsofautosomes)embryos.TheautoregulatoryfeedbackloopregulatesSxlexpressionthroughoutdevelopmentandadultlife.Sxlcontrolstheexpressionofthetraandmsl-2genes,whoseproductsarerequiredforcontrolofsomaticsexdetermination/sexualbehavioranddosagecompensation,respectively.Thedottedlinesindicatethattheexpressionofthegeneis“off,”andthesolidlinesindicatethattheexpressionofthegeneis“on”.见:MICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGYREVIEWS,Sept.2003,p.343359,果蝇性别因子mRNA的可变剪接,雌果蝇SXL阻止msl内含子切除及翻译起始,果蝇X染色体补偿是通过提高雄性X染色体基因的转录水平实现的.通过msl基因产物及roXRNA等与染色体结合增强转录.雌性细胞中mslmRNA的加工及翻译均受到SXL蛋白的抑制.,mRNA前体的可变剪接扩充了基因的信息内含,神经生长导向因子mRNA的可变剪接,Schmucker,D.,DrosophilaDscamisanaxonguidancereceptorexhibitingextraordinarymoleculardiversity.Cell101:671684,2000.,(Dscam)gene的结构与进化,TheexonintronorganizationoftheDscamgenefromeachorganismisshown.Theblackexonsareconstitutivelyspliced.Thealternativeexonsintheexon4,6,9,and17clustersareshadedinred,purple,green,andblue,respectively.Thenumberofvariableexonswithineachclusterineachorganismisindicatedbeloweachcluster.Theexon10clustersinA.gambiaeandA.melliferacorrespondtotheexon9clusterintheDrosophilaspecies.Theexon14and22clustersinA.gambiaeandA.mellifera,respectively,correspondtotheexon17clustersintheDrosophilaspecies.,果蝇DSCAMmRNA可变剪接说明,果蝇的DSCAM（downsyndromecelladhesionmolecular，唐氏综合症细胞粘连分子）基因编码神经轴突导向受体（axonguidancereceptor），该分子的胞外功能域中有一段多肽由10个免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）重复单位组成，其中第4，6和9重复单位由可变剪接产生。DSCAM的功能涉及果蝇躯体约250000个神经元在发育过成中的迁移与连接，指令轴突应该到达的位置。DSCAM基因的外显子与内含子组成非常特别，其外显子4，6，9和17均由许多顺序相似但略有不同的亚单位组成独立的可变剪接区，分别有12，48，33和2种剪接方式。在每个成熟的mRNA中，外显子4，6，9和17都只有一个亚单位入选，全部可能的剪接方式为1248332=38016种，产生38016个不同的蛋白质（Schmucker，2000）。在已经克隆与测序的50个DSCAMcDNA中，发现49种不同的4，6和9外显子组合。目前还不知到细胞采取何种机制来挑选不同的外显子成员，也不清楚由此产生的蛋白质在功能上究竟有何种差别。,果蝇Dscam基因的可变剪接,声波感应蛋白基因（slo）的可变剪接,真核生物可变剪接的比例,Thebartotheleft(lightpurple)foreachorganismshowstheestimateofalternativesplicingbasedonallESTsandthetotalnumberofpublishedmRNAsequencesandESTsforthespecies:Homosapiens,23,161mRNAsand3.1millionESTs;47%Musmusculus,9,682mRNAsand1.9millionESTs;Rattusnorvegicus,5,803mRNAsand263,362ESTs;Drosophilamelanogaster,2,973mRNAsand115,191ESTs;Bostaurus,1,370mRNAsand159,130ESTs;Caenorhabditiselegans,18,821mRNAsand108,115ESTs;Arabidopsisthaliana,3,084mRNAsand112,112ESTs.,人类与小鼠直系基因可变剪接比较,人类与老鼠种间同源基因的可变剪接模式基本相同,也有少数外显子的剪接表现差异.NatureGenetics,34:177-180,2003,物种间同源基因差异剪接的外显子多为新生外显子,可变剪接的机制,mRNA可变剪接机理的研究,1)有多少基因发生可变剪接?2)每个基因有多少可变剪接?3)不同的可变剪接产物是否都有功能?是否有功能趋异?4)不同可变剪接产物之间的比例是如何控制的?5)可变剪接类型是否具有组织细胞专一性?6)哪些因素控制可变剪接?7)可变剪接与表型之间的关系.8)可变剪接是否与遗传病有关?9)可变剪接究竟有什么生物学意义?,超长内含子如何剪接,三种超长内含子剪接模型,人类基因最长内含子800kb,最短内含子10bp.,果蝇基因最长内含子,1)10%的人类基因和5%的果蝇基因含有10kb的内含子.2)果蝇的Y-linkeddynein(动力蛋白)heavychain基因(DhDhc7)位于Y染色体的异染色质区,其内含子20长度为3500kb(3.5Mb)，相当于大肠杆菌基因组的四分之三。根据转录速率每秒钟45nt计算,推算完成该内含子的拷贝约需22小时，它的剪过程与一般的内含子不同，可能采取滚动剪接。,长内含子的滚动剪接,AU-AC内含子的剪接方式,AUAC内含子的剪接1)近年来发现真核生物中少数mRNA内含子并不归属GT-AG范畴,而有不同的剪接位置，即AUAC内含子。在人类，植物以及果蝇等不同生物中已发现20多个基因含有这种内含子（TarnandSteitz,1997）。2)AUAC内含子也有特征性的分枝点即5UCUUAAC3，该基序中最后的腺苷酸参与第一个转脂反应。这一点向我们指出了AUAC内含子的显著特征：它们的剪接路线与GTAG相同，但涉及不同的剪接因子。3)只有U5snRNP参与GU-AG和AU-AC二种内含子的剪接过程。在GU-AG内含子中起作用的U1snRNP和U2snRNP在AUAC中由U11snRNP和U12snRNP取代，另一个全新的U4atac/U6atac-snRNP随后也被发现。这二个剪接过程从不同侧面展示了剪接体中snRNP之间互作的详情。4)已经证明GUAG内含子剪接的模式同样适用于AUAC内含子。,转录与加工偶联,mRNA的反式剪接,mRNA的反式剪接系指由两个不同mRNA分子经剪切连接形成成熟mRNA的现象,主要出现在底等真核生物如原生生物和线虫中,它们有大量的基因以操纵子形式组成多顺反子结构.1)锥虫(非洲磕睡虫)的所有mRNA均为反式剪接.2)线虫约10-15%的编码基因为反式剪接.3)果蝇某些基因,植物线粒体基因也有反式剪接.,锥虫mRNA前体的反式剪接,反式剪接的其它例子,1)裸子植物线粒体基因的反式剪接.见PNAS94:553-556,19972)绿藻Chlamydomonasreinhardtii叶绿体基因的反式剪接.见:PlantJournal15:575,1998,3)大鼠(rat)肝细胞中存在前体mRNA的反式剪接.见PNAS95:12185-12190,19984)果蝇mod(mdg4)基因存在反式剪接.见Genetics160:1481-1487,2002,反式剪接策略可用于基因治疗,Pptm+Sp表达载体可用于反向剪接产生细胞毒素蛋白mRNA,杀死癌细胞.,人类肝脏细胞细胞色素P450A基因的反式剪接TheJournalofBiologicalChemistry,277:5882-5890,2002,在CYP3A4基因的转录产物有三种mRNA,它们的5端均含有CYP3A43基因的外显子1.因为CYP3A43位于CYP3A4基因邻侧,转录方向相反,因此推测CYP3A4的三种mRNA系由反式剪接产生.,真核生物rRNA的剪切依赖snRNA(U3,U8)的参与,真核生物tRNA内含子采取相同机制剪接,真核生物tRNA前体的内含子相对较短，并且在成熟tRNA中所处位置相同，均位于反密码子环内，但缺少共同的基序。tRNA内含子的剪接不涉及转脂反应。2个剪接位点由tRNA内切核酸酶（endonuclase）产生，位于上游外显子3末端的3-磷酸基团与其2-羟基环化，下游外显子5端留下一个游离的羟基基团。这2个末端因tRNA分子自然形成的碱基配对构型而相互接近，然后由RNA连接酶使两个末端形成3-5磷酸脂键。,真核生物tRNA的剪接由tRNA内切核酸酶与RNA连接酶负责,tRNA的内含子是在形成三叶草构型之后剪除的.,rRNA的化学修饰,rRNA有二种修饰方式：1）将甲基基团加到核苷酸糖基的2OH位，这是主要的修饰类型；人类前体rRNA有106处甲基化.2）使尿苷酸转变为假尿苷酸,人类rRNA有95处假尿嘧啶修饰.细胞中所有rRNA均在相同的位置发生相同的修饰。这种修饰在不同种属间具有某种程度相似性，如细菌和真核生物中修饰的模式大体一致，但真核生物的修饰更加广泛。目前还不了解前体rRNA化学修饰的全部意义，但大多数rRNA中出现的化学修饰被认为对其在核糖体中的活性极为重要。例如，修饰的核苷酸可能涉及rRNA催化多肽键的反应。,rRNA核苷酸假尿嘧啶修饰,rRNA核苷酸的甲基化修饰,snoRNA负责rRNA分子的修饰,真核生物snoRNA在RNA修饰过程中扮演了关键角色。snoRNA长度在70100个核苷酸之间，主要位于核仁区。这里既是rRNA合成的场所，也是其加工的场所。1)C/D盒snoRNA负责2-O-核糖甲基化snoRNA中有一段称为D盒（Dbox）的顺序，它们总是位于互补区段下游5个碱基的位置处，与之配对的rRNA核苷酸将被修饰。这些snoRNA组成了C/D盒家族，负责2-O-核糖甲基化。D盒是甲基化修饰酶识别的信号。2）H/ACA盒snoRNA负责假尿嘧啶修饰在发现C/D盒snoRNA之后，又找到另一个H/ACAsnoRNA家族，它们的作用是引导修饰酶将rRNA尿苷酸转变为假尿苷酸。这些snoRNA虽然没有D盒，但仍有保守的基序可与rRNA靶位形成碱基配对，并含有修饰酶识别的信号。,snoRNA保守的D/C盒与H/ACA盒,snoRNA的结构,大多数snoRNA由内含子编码,人类基因组中大多数snoRNA由内含子编码,1）rRNA前体每个被修饰的位点都有一个对应的不同的snoRNA。根据修饰的位点推测，每个细胞必需有数百个不同的snoRNA。2）目前仅有极少数snoRNA基因被定位，估计只有少数snoRNA分子是从标准的基因转录的，大部分成员可能来自基因的内含子，经剪接后再释放出来。如U14-U24（除U22外）和U32-U40基因位于蛋白质编码基因的内含子中，而U22和U25-U31则位于一个编码RNA分子的基因内，其产物也经RNA剪接释放snoURNA。,tRNA与细菌rRNA的修饰,1)原核生物和真核生物tRNA的修饰均由酶催化2)细菌rRNA的修饰由酶催化以上的修饰不涉及其它RNA分子,mRNA编辑的类型,1)碱基修饰,如将CAA转变为UAA.2)泛编辑(pan-editing),在guideRNA指导下在mRNA分子内插入若干U.3)插入编辑,在mRNA合成时插入碱基,改变读框.4)多聚A编辑,在mtmRNA尾部加上一连串A,产生终止密码.,mRNA碱基更换编辑,线粒体COXIIImRNA的编辑,泛编辑（panediting）：插入U锥虫mtmRNA可通过不同的gRNA进行可变编辑.,脱脂蛋白apo-BmRNA的编辑,腺嘌呤脱氨基,果蝇paramRNA的编辑(ag),腺嘌呤脱氨基生成次黄嘌呤,后者的化学特性类似鸟嘌呤.,果蝇paramRNA加工与修饰后的类型,1）果蝇paramRNA有1536种可变剪接；2）paramRNA有11种RNA的编辑方式；3）理论上paramRNA可产生1032192种顺序不同的mRNA。,哺乳动物GluRmRNA的编辑,1）哺乳动物神经系统glutamatereceptorsubunitgene（GluR）基因为神经细胞跨膜蛋白，对神经传递分子谷氨酸作出响应，在记忆与学习中起重要作用.GluR可开通离子通道，启动神经脉冲。2）GluRmRNA在转录后可由ADAR（adenosinedeaminaseedtingonRNA）编辑，将A转变为I（inosine，次黄嘌呤）。,人类线粒体mRNA的编辑,1）人类线粒体有13个mRNA,其中5个mRNA均以U或UA尾,无终止密码；2）通过编辑可将U或UA转变为UAAAA-，产生终止密码UAA。,植物叶绿体与线粒体mRNA的编辑,1）叶绿体基因总数约150左右，烟草叶绿体基因mRNA的编辑位点数约30个；2）高等植物线粒体基因总数在60-90之间；烟草线粒体基因mRNA的编辑位点超过400；3）细胞器基因大多数的编辑为CU；4）叶绿体mRNA的编辑信号为-22nt-C-16nt-：-CUUAAUCCGAAUUAUAGAGCUACGACACAAUC-,叶绿体mRNA编辑机制,核酸开关(riboswi-tch),见:Science306:233-234,2004.Nature428:281-286,2004.已报道枯草杆菌中约20%的基因具有riboswitch调控机制.GenomeResearch,6:315,2005,mRNA的定位机制,1)mRNA的局限合成2)mRNA的局限保护性降解3)mRNA的扩散:随细胞骨架的组装极性分布4)区域锚定:主动运输,依赖顺式元件和反式因子转移到工作场所.如神经细胞轴突生长与花粉管的伸长.,老鼠神经成纤维细胞-actinmRNA的定位过程,ZBP1(Zip-codebindingprotein1)蛋白控制-actinmRNA转运及其翻译的工作模型.ZBP1在细胞核中与-actinmRNA结合,输出细胞核后立既与40S核糖体亚基结合,并通过MP蛋白装载到细胞骨架运输线上.在到达指定位置(突出生长边缘),然后在Src激酶作用下ZBP1与mRNA脱离,释放的mRNA和40S亚基再与60S亚基结合起始翻译.见:Nature438:512-515,2005,mRNA的降解,1)mRNA的降解是基因表达调控的重要内容之一,mRNA的降解涉及正常mRNA和异常mRNA。2)真核细胞中有一定比例的异常mRNA，它们具有前移的终止密码，可产生残缺蛋。如人类细胞平均约20%的mRNA编码残缺蛋白质.有的mRNA具有无终止密码的3-非翻译区,影响核糖体的利用效率.。3)细胞必需将不再需要的mRNA和异常的mRNA及时清除，以保证细胞正常的功能。4)真核细胞有多种mRNA降解机制，针对不同的mRNA。,细胞内异常mRNA的降解,降解mRNA的类型,从编码功能可将mRNA划分为正常mRNA和非正常mRNA:正常mRNA:具有正常编码顺序,但细胞内已经不再需要的mRNA.不同mRNA的半衰期有很大差别,从数分钟到几十分钟.非正常mRNA:1.无终止密码mRNA;2.密码子前移的mRNA,编码残缺蛋白质.非正常mRNA主要来源于:1)发生点突变的假基因;2)mRNA加工过程中发生差错产生的mRNA,如缺少poly(A)的mRNA;3)可变剪接产生的非正常mRNA.,mRNA降解的4条路线,1)依赖于3-poly(A)脱腺苷酸和5-脱帽的53降解路线,真核生物正常mRNA和部分非真常mRNA的降解采取这一路线,是主要的mRNA降解路线.2)依赖于3-poly(A)脱腺苷酸和35降解路线,采用exosome降解mRNA.3)内切核酸酶降解路线.4)独立于3-poly(A)脱腺苷酸直接5-脱帽的53降解路线,或称质量监控路线.,mRNA降解的四条路线,见:Annu.Rev.Biochem.73:861-890,2004.,影响mRNA5-脱帽的因素,影响mRNA半衰期的顺式因子位于mRNA的5-UTR区、编码区和3-UTR区，这些成分依其功能可分为稳定成分和非稳定成分。,MIE和PGK1的功能,MIE：mRNA不稳定成分，顺式作用1）酵母Mat1a（MatinghormoneA-factor2precursor，或Mat1a，结合激素A因子前体）mRNA是一种极不稳定的mRNA，在其编码区有一段65nt的顺序是加速mRNA降解必需的成分，称之为MIE（Mat1instableelement）。Mat1amRNA5UTR区35nt内含有一些罕见的密码子，其32nt碱基可激发mRNA的降解。Mat1amRNA的加速降解在翻译时发生的，Mat1amRNA在翻译时核糖体停留在某些顺序位置，由此引发mRNA的降解