重组质粒构建.ppt

DNA重组质粒的构建,医学生物所病毒免疫室,基因克隆genecloning应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细菌或细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝。核心技术：DNA重组技术（recombinantDNAtechnique）,基因克隆的基本程序：分切接转筛PCR酶切连接转化phage;viral;BAC;YAC根据用途分：克隆载体；原核生物表达载体；真核生物表达载体根据与宿主的关系分：整合性载体、非整合性载体基因工程中用得最多的是plasmid载体。下面介绍几种常见的载体。,载体的基本结构单元：1.复制起点2.克隆位点3.筛选标记其他条件：4.适当大小5.易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。,质粒(Plasmid),质粒是独立于宿主细胞（如细菌）染色体之外的可进行复制和遗传的遗传单位-双链闭合环状超螺旋DNA分子。是一种环状的双链DNA分子，大小从1K-200Kb。,通常质粒含有某些染色体没有的基因，负责编码某些功能蛋白，这些功能并不是细菌生存所必需的，但在一定环境下，可对细菌宿主的生存有利。由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性（R因子）、产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生大肠杆菌素（大肠杆菌素因子col）、肠毒素及限制酶、修饰酶等。质粒存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。它们复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。,质粒DNA的特征,质粒复制依赖宿主细胞的复制机器，但可以独立复制。（单拷贝或多拷贝：紧密型质粒和松弛型质粒）严紧型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝,不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。质粒DNA所编码的基因产物赋予细菌某些性状特征。质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质，可以在细菌间转移与丢失。质粒可自行失去或经人工处理而消失可有几种质粒同时共存在于一个细菌内，但同群质粒有不相容性（同群质粒具有同源性，可以产生相同的阻遏蛋白，故彼此间有相互抑制作用，不能共存于同一细胞）,（四）人工构建质粒的基本元件,启始复制子：使质粒在宿主细胞中能够复制抗性基因：用于筛选阳性克隆。多克隆位点：插入外源基因。对于表达载体还需要启动子、多聚A尾等.易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。,pBR322plasmid是一个克隆载体，作为一个克隆载体最基本的要求都具备：复制起点:Ori克隆位点:EcoRI;HindIII;BamHI;SalI筛选标记:Ampr。,T-vectorPCR产物亚克隆载体,TVector是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体，由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3末端添加一个“A”的特性,所以用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。T-vector克隆PCR产物时用高效连接液LigationSolutionI可以在极短的时间内(30分钟1小时)完成连接反应，大大地方便了实验操作。用途克隆PCR产物。对克隆后的PCR产物使用M13primers进行DNA测序。,原核生物表达载体Bacterialexpressionvector,复制起点克隆位点筛选标记启动子转录终止序列核糖体结和位点：起始密码子ATG和SD序列（翻译识别）,原核生物表达载体的基本结构单元包括：,真核生物表达载体（mammalianexpressionvector),真核生物表达载体的结构单元,复制起点（真核和原核）克隆位点筛选标记(原核和真核标记）增强子/启动子PolyA终止信号,LocationofFeaturesPCMVIE:CMVIEenhancer:1-659CMVIEpromoter:669-750Interveningsequence(IVS):890-1022T7RNApolymerasepromoter:1067-1085Multiplecloningsite:1085-1137T3RNApolymerasepromoter:1158-1137SV40fragmentcontainingpolyadenylationsignal:1167-1388f1originofreplication:1483-1938,EGFPexpressioncassette:2002-3455SV40enhancer/earlypromoter:2002-2420EGFPstructuralgene:2449-3168Kozakconsensustranslationinitiationsite:2442-2452Startcodon(ATG):2449-2451;Stopcodon:3166-3168InsertionofValatposition2:2452-2454GFPmut1chromophoremutations(Phe-64toLeu;Ser-65toThr):2731-2735His-231toLeumutation(A-T):3143Bovinegrowthhormone(BGH)genefragmentcontainingpolyadenylationsignal:3182-3455SV40originofreplication:2318Ampicillinresistance(b-lactamase)gene:3449-4709Startcodon(ATG):3849-3451Stopcodon(TAA):4707-4709,噬菌体载体,噬菌体(phage)外源DNA：923kb常用：EMBL系列、gt系列、charon系列粘性质粒(cosmid)：DNA的cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：4050kbM13噬菌体,噬菌体(phage)特点：一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型为双链线状DNA分子，长度48.5kb,分子两端各有一个12bp组成的粘性末端,感染大肠杆菌后,线状DNA通过粘性末端互补连接成环,连接处称COS位点。1.本身有复制体系;2.中间(J-N间)是生长非必需区,可被其它外源DNA取代;,3.DNA在体外可包装成病毒颗粒,感染效率高;4.载体容量大,可装入大片段外源DNA(20kb);5.可人工加入多克隆位点;6.筛选容易噬菌斑筛选;7.主要用于DNA文库构建.,插入型载体含单一的限制性酶切位点，可接受10kb以下的外源片段，可用于cDNA文库构建；取代型载体含某一限制性酶的两个切点，可接受20kb左右的外源片段，可用于基因组DNA文库构建。,粘性质粒(cosmid)是一种人工改造的载体,双链环状DNA，含有DNA的cos区+质粒，克隆容量：4050kb1.-DNA的COS位点;2.质粒的复制起点和抗药性标记(Ampr);3.多种单一的酶切位点.,cosmid较小,约46kb,可容纳40-45kb的外源DNA,由于噬菌体DNA包装时包装蛋白识别的只是DNA粘性末端附近的一小段顺序，因此只要一个质粒接上此粘性末端顺序，再加上外源DNA片段使其长度为野生型DNA大小的75105%，重组体可象噬菌体一样进行外壳装配,形成噬菌体颗粒,感染大肠杆菌效率比质粒高得多,进入宿主细胞后,只能象质粒一样扩增,并依赖抗药性被筛选.,优缺点:1.克隆效率高;2.可利用质粒DNA的方式扩增;3.可克隆较大DNA片段;主要用于真核基因的克隆,基因组文库构建4.缺点:产生串联现象。,M13噬菌体一种丝状单链噬菌体，闭环正链ssDNA，全长6.5kb,感染大肠杆菌后,ssDNA转变为dsDNA,可用作克隆载体.最大优点：产生单链DNA,可制备单链DNA探针.,构建基因文库的克隆载体,粘粒(Cosmid)细菌人工染色体(BAC)酵母人工染色体(YAC)P1噬菌体人工染色体(PAC),P1及YAC载体酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长达200kb-1000kb，含有酵母第4号染色体的着丝粒和自主复制序列CEN4、ARS1，作为端粒的Tel序列，选择性标志URA3、TRP1和SUP4，能在酵母中稳定的复制，常用于大的染色体基因组DNA文库构建。,一个典型的YAC系列载体,病毒载体DNA病毒在细胞中具有较高的拷贝数，并有较强的启动子，因而是基因工程载体的理想候选者。诸如：SV40（猴肾病毒）Epstein-Barr病毒(EBV病毒)牛乳头瘤病毒（BPV）昆虫杆状病毒（baculovirus),由于存在容量小、宿主范围小等缺陷，天然SV40病毒作为载体很少被使用，多数载体为带有来自SV40中转录元件的质粒型载体SV40增强子、启动子和复制子，可以在哺乳动物细胞中产生高效的组成型表达。SV40polyA信号，可以对转录产物进行加工，稳定转录产物的活性。Zeocin抗性基因，可作为大肠杆菌及哺乳动物细胞的选择标记。Zeocin抗性基因在大肠杆菌中的合成由EM-7启动子控制，在哺乳动物细胞中的表达由CMV启动子控制，既可用于瞬时表达，也可用于筛选稳定表达的细胞系。f1复制子，可产生单链DNA。ColE1复制起始位点，使质粒可在大肠杆菌中复制扩增。,EB病毒,EB病毒,Epstein-Barr病毒(EBV病毒)是人类疱疹病毒,可转化人的B淋巴细胞，在转化细胞中以染色体外附加体形式存在。EBV病毒的顺式作用因子oriP可以在带有EBVDNA并表达具有反式作用的EBNA1抗原的贴壁细胞中维持附加体DNA分子的存在，因而能作为构建表达载体的元件，该类载体也主要用于建立带有多拷贝外源基因的细胞系。可在多种细胞中表达，可表达基因组DNA和cDNA,可为表达细胞系。,ComparisonofdifferentcloningvectorsVectortypeLengthofclonedDNAPlasmid20kbPhage25kbCosmid45kbP1vector100kbBAC100Kb(bacterialartificialchromosome)YAC1,000kb(yeastartificialchromosome),DNA重组操作过程,一把特殊的剪刀限制性内切酶,30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖,限制性内切酶的特点：限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如PvuII（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的CjeI更大除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。,限制性内切酶的命名,限制性内切酶命名的次序如下：A用3个字母代表来源的生物，如大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示。B1个字母或阿拉伯数字代表菌株（EcoR、Hind）C1个罗马字母代表发现或鉴定的次序（EcoRI、HindIII）,限制性内切酶的分类,按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素限制性内切酶可划分为三大类：I型限制性内切酶II型限制性内切酶III型限制性内切酶,I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。其特点是识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，不产生确定的限制片段和明确的电泳条带，因而不具备实用性。III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种功能的酶。虽然有特异切割位点，但它们在识别位点之外切开DNA链，很少能产生确定的切割片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。,II型限制性内切酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带，因此是三种限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。实际上，从已知的情况上看，这些酶很可能是在进化过程中各自独立产生的，而非来源于同一个祖先。,II型限制性内切酶中最普遍的是象HhaI、HindIII和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoRI识别GAATTC）；而另一些识别不连续的序列（如BglI识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶的切割后产生一个3羟基端和一个5磷酸基团。它们的活性要求镁离子的存在，而相应的修饰酶则需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小，亚基一般都在200-300个氨基酸左右。,一些概念,粘末端和平末端同尾酶同裂酶同识异切酶消化星号活力,限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：钝性末端(bluntend)粘性末端(stickyend),同尾酶,有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶，可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如Xba(TCTAGA)、Nhe(GCTAGC）、Spe(ACTAGT)切割的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点，即Bfa（CTAG)的酶切位点。,有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如Hpa和Msp的识别顺序都是5CCGG3，如果其中有5-甲基胞嘧啶，则只有Hpa能够切割。这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。,同裂酶,限制性内切酶在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。星号活性的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。因此,尽量采用规范的实验步骤,应用推荐的反应条件。,星号活力,克隆（有时与甲基化酶联用）鉴定（基因片断大小、正反向）检测突变（识别位点，限制酶切图谱的多态性RFLP）制作Marker,限制性内切酶的应用,限制性内切酶的使用,一个标准的酶切反应包含：DNA合适的酶缓冲液蛋白酶为了提高酶切效率，可加入BSA。,1、建立一个标准的酶切反应通常，10个单位的内切酶可以切割1g不同来源和纯度的DNA。一个50l的反应体系中，1l的酶在1XBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1g已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。一般说来，线性DNA比超螺旋DNA更易消化。比如，酶切1uglambdaDNA，需要1-2单位的酶，而酶切1ug质粒DNA，需要3-5单位的酶。,应用中的注意点,2.选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。内切酶的产物可以是粘端的（3或5突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接,3、加酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。,4、DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素,5、缓冲液对于每一种酶都提供相应的最佳缓冲液，可保证酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100g/ml的BSA以实现最佳活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响,6、反应体积内切酶活力单位的定义是：1小时内，50l反应体积中，降解1g的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）,7、混合这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！,8、反应温度大部分酶的反应温度为37；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65不等,9、反应时间1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全,10、终止反应如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。我们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mMEDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10l/50l反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65或85，20分钟）。热失活并不能适用于所有的酶。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。,11、贮存大部分酶应贮存于-20。少部分酶则须在-70长期保存。10XBUFFER和100XBSA于-20保存。BSA不能与Buffer混合后保存，否则将会出现BSA沉淀,12、稳定性大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20条件下十分稳定。高于-20条件下稳定性将有所降低,13、对照反应如果发现DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：将不加内切酶的底物DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合物里的对照DNA也无法被切开,使用限制性内切酶的一般步骤,A）测试酶切DNA的量B）计算完全酶切所需的酶量。为使终体积中甘油的浓度低于8%，计算能加的酶量，最多能加终体积的10%（甘油的浓度为5%）。C）10X反应液的体积应为终体积的1/10；10X反应液的体积不应小于酶的体积。D）加入计算好的DNA，10X反应液，酶。加入水到终体积（20-50ul），轻轻混匀，在适当的温度下保温。一般酶的最适温度为37oC，但有例外。应查讯分析说明。,举例,质粒DNA（2ug/ul）5ul10X反应液5ul内切酶2uldH2O38ul总体积50ul37oC保温2-3小时。应最后加酶。,提高限制性核酸内切酶对低纯度DNA制剂的反应效率，可采用的方法,增加限制性核酸内切酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10个活性单位甚至更多些。扩大酶催化反应的体积，使潜在的抑制因素被相应的稀释。延长酶催化反应的保温时间。,能否在一次反应中用很多的限制性内切酶？可以，一般而言，甘油浓度超过8%对酶切有抑制。有些酶在高的甘油浓度中会产生星号活力。限制性内切酶提供在50%的甘油中，故10ul反应体积中不应加入超过1.6ul的酶。,6.双酶切：根据重组的需要，有时需要用双酶切（单酶切：由于只有一种酶切，载体片段很容易相互粘连，形成空载体），这样重组效果会更好。双酶切时要先分析两种酶且的条件，根据两种酶切的缓冲液要求，有三种情况,7.载体的酶切：酶切条件与外源DNA没有区别。载体多位环状DNA,如果只有一个酶切位点，用单酶切。目前商业化载体均有多克隆位点，含有多个酶切位点，可以进行多种选择和取舍。,酶切产物回收,离心柱回收纯化酶切产物DNA片段纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。,数据库,限制性内切酶的数据库,连接酶（ligase),主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。催化相邻DNA链的5-P和3-OH末端以磷酸二酯键结合。E.coliDNA连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只