基因工程原理与技术-5ppt课件

.,1,第五章聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)PCR是体外快速扩增目标DNA序列的技术1971年Khorana等提出“在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA”的设想。1983年Mullis发明了PCR技术。1988年Saiki等将耐热TaqDNA聚合酶引入了PCR技术。1989年PCR被美国Science杂志列为十余项重大科学发明之首。1993年Mullis荣获诺贝尔化学奖。应用领域：生命科学、医学、法医学及考古学。,.,2,第一节PCR原理遵循DNA体内复制原理，半保留式扩增；扩增序列取决于设计一对引物(正向引物、反向引物)，有效扩增长度为2kb左右；扩增循环包含变性、退火、延伸3个阶段；3035个循环后，目标序列呈指数级扩增(2n-2),.,3,第二节PCR反应体系一、反应体系,.,4,二、反应参数,.,5,三、影响PCR的因素1、反应成分引物；浓度、长度DNA聚合酶；种类(Klenow酶、Taq酶、Pfu酶)、用量dNTP；浓度、比例Mg2+；影响TaqDNA聚合酶的活性和真实性、引物退火、模板解链温度、产物的特异性、引物二聚体生成等。反应缓冲液；pH8.3，KCl能促使引物退火、但浓度大于50mmol/L抑制酶活性。模板DNA。用量，线性DNA扩增效果大于环状DNA。,.,6,2、反应条件变性的温度和时间；热启动降低非特异性扩增退火的温度和时间；取决于引物的长度、浓度和碱基组成，退火温度为Tm-5。退火温度越高，扩增特异性越高。延伸温度和时间。延伸时间长短取决于目标序列的长度、及延伸温度的高低。对2kb长目标序列扩增时间多采用1min(72时)。,.,7,四、平台效应平台效应是指PCR反应后期扩增产物不再随循环次数而明显上升、反应曲线变得平坦的现象。,.,8,引起平台效应的因素：dNTP或引物等消耗殆尽；酶活性逐渐降低；最终产物的阻化作用(焦磷酸盐、双链DNA)；非特异性产物与模板的竞争作用；在高产物浓度下产物变性不完全；低浓度的非特异产物开始大量扩增。PCR的特点：灵敏度高简便、快速对样品纯度要求低,.,9,第三节聚合酶链式反应引物设计原则一、引物设计的总原则提高特异性扩增，降低非特异性扩增。二、引物设计的一般原则引物长度应为1530个核苷酸，Tm接近72较佳；Tm(GC)4(AT)2引物中碱基分布应是随机的，避免出现一连串单一碱基以致产生二级结构；GC碱基的含量在4555左右；引物3端必须与模板互补，5端可以不互补引物中连续互补碱基应小于4个；引物间连续互补碱基应小于4个。,.,10,三、引物3端的末位碱基引物3端的未位碱基：优选A，其次是G、C，不要选T。因为当未位碱基为T时，即使在错配的情况下也能引发链的合成；而未位碱基为A时，错配时的引发效率大大降低；若为G或C，则引发率居于其间。当然，设计简并引物时，3端末位碱基选T会得到较好的效果。四、引物设计软件Oligo6.57Primer5.0,.,11,第四节PCR的类型一、已知DNA序列的PCR扩增1、巢式PCR不受平台效应限制，扩增灵敏度增加1000倍，,.,12,2、热巢式PCR第二对引物之一标记放射性物质，电泳检测时灵敏度增高，可测出106个细胞中的一个DNA分子。3、半巢式PCR(见下图),.,13,4、不对称PCR采用两种不同浓度的引物(50:1)。主要用于制备DNA测序的单链模板以及制备杂交探针。,.,14,5、等位特异性PCR用于检测点突变。在引物的3端设计了突变碱基，突变引物与正常模板间扩增受阻，电泳分析时，不出现谱带，反之则会出现特定谱带。但有些错配碱基不能完全阻止引物延伸。6、竞争引物PCR用于检测特定位点的点突变。设计两个等位特异性引物，一个是正常的，另一个是突变引物，而且突变碱基在引物中间，其扩增产物相差20倍以上。由于一个引物被标记，能检测出不同样品的的扩增差异。常为A/A、G/G、G/A、C/A、C/C、T/C、T/G。,.,15,7、降落PCR在一次PCR中，设计多循环反应的程序，第一个程序的退火温度高于Tm，以后每个程序的退火温度逐渐降低，确保第一次扩增的特异性，这样后面的低退火温度不会影响扩增的特异性，因为在开始的几个循环中，目标产物已指数级扩增。常用于根据氨基酸序列设计简并引物的扩增、多基因家族成员的扩增。,.,16,二、逆转录PCR(RT-PCR)逆转录PCR是指先以mRNA，以oligo(dT)n为引物在逆转录酶作用下合成cDNA第一链，然后用已知一对引物扩增cDNA片段的技术。主要用于基因表达、cDNA克隆、逆转录病毒鉴定等研究。,.,17,RT-PCR引物设计原则：引物限定区最好为180500bp；引物5和3端不应存在回文序列结构；用oligo(dT)n作逆转录第一链cDNA的引物时，有义引物应尽量位于RNA的3端；在引物限定区内，基因组DNA最好有一内含子，这样可检测污染情况；PCR引物限定区内最好有一酶切位点，以便鉴定产物；,.,18,三、快速扩增cDNA末端(RACE，锚定PCR),杂合引物:17ntoligo(dT)(锚定引物)+带限制酶位点的序列。基因特异引物5RACE的缺点：不能获得真正的5末端。因为过早终止第一链cDNA像全长cDNA一样，可被末端转移酶同样有效地加尾。,3RACE,5RACE,.,19,新5RACE(加帽法),.,20,四、已知序列的侧翼未知序列的PCR扩增1、反向PCR,.,21,2、锅柄PCR,.,22,五、未知序列PCR扩增1、差异显示PCR,锚定引物,N9：随机引物,.,23,2、减法PCR,例如：受试者为感病材料；驱动者为正常材料,.,24,六、荧光定量PCR(实时定量PCR)荧光染料(EB)：结合双链DNA会使荧光增强，但结合无特异性。荧光标记探针(见图)：利用Taq酶的外切酶活性，扩增时切断探针释放出荧光基团，使荧光增强。特异性强用途：检测病原菌、基因表达。,R：荧光基团；Q：淬灭基团,.,25,第五节PCR技术应用一、基因克隆及筛选二、基于PCR分子标记RAPD、SSR、AFLP等，应用在遗传图谱构建、生物进化、遗传多样性等方面的研究。三、DNA测序四、突变检测五、基因表达检测六、病原菌检测与疾病