土壤中放线菌的分离

土壤中放线菌的分离实验目的： 1掌握制备合成培养基的一般方法。掌握2稀释反平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。掌握3平板刻划法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。实验资料：药品：可溶性淀粉，KNO3，NaCl，K2HPO43H2O，MgSO47H2O，FeSO47H2O，琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭转天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、绳、无菌培养皿、铁锹、铁锹、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理：皋一号合成培养基是培养放线菌的培养基。 该培养基是采用化学成分完全清楚的纯试剂制备的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉，氮源为KNO3、NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O为无机盐，FeSO47H2O为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。放线菌是一种重要的抗生素产生菌，主要分布于土壤中，数量仅次于细菌，多见于中性碱性、有机质丰富、透气性好的土壤中。 因为土壤中的微生物是各种微生物的混合体，为了研究某些微生物，需要从这些混合微生物群中分离出来，得到某些菌株的纯培养。 分离放线菌常用稀释反平板法。 根据放线菌的营养、酸碱度等条件，经常选择合成培养基或有机氮培养基。 培养基的成分变化，土壤的预处理(120下1h热处理)，加入某种抑制剂(例如加入数滴10%苯酚等)，细菌和霉菌的发生数大幅减少，其他的杂菌被淘汰。 稀释法可使放线菌在固体培养基上形成单个菌落，得到纯菌株。实验步骤：1 .高氏1号合成培养基的制备高氏1号琼脂培养基(放线菌培养用)可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、氯化钠0.5g、K2HPO4 3H2O 0.5g、MgSO47H2O 0.5g、FeSO47H2O 0.01g、琼脂20g、水1000ml、pH7.27.4 .调制时，首先用冷水将淀粉制成糊状，倒入煮沸的水中，用火加热，边搅拌边加入其他成分，溶解后，补充水分至1000ml。 在112灭菌20分钟。2 .土壤中放线菌的分离(1)测定对象试样液的制备选取取样点(优选有机质含量高的菜园)，以对角交叉(五点法)取样。 首先去除表层约2cm的土壤，将铁锹插入土中数次后，采集210cm的土壤。 盛土的容器必须是无菌的。 将5个样品约1kg充分混合，去除碎石、植物残根等，取土样后应尽快投入实验。土样1g加入99mL的无菌水或无菌生理盐水，放入加有玻璃珠的三角烧瓶中振荡1020min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，用10-2浓度的菌悬浊液静置30s。 取出3根装有9ml无菌水的试管，编号10-3、10-4、10-5。 用无菌吸管采集1 ml 10-2浓度的土壤悬浊液，放入编号10-3的无菌试管中，喷射23次吸管，与9ml水混合，形成10-3浓度的土壤稀释液。 以下同样，直到稀释到10-5的试管为止(每稀释度更换1根无菌吸引管)。 稀释过程在无菌室或无菌操作条件下进行。(2)稀释反平板法分离土壤中的放线菌取2根1毫升移液管，分别从10-5、10-4菌悬浊液中吸收1毫升菌悬浊液，分别注入编号10-5、10-4的培养皿中。 将温度为4550的高氏1号培养基放入上述各培养皿中，轻轻旋转，充分混合菌悬浊液，凝固后，将培养皿放置在加热的地方(28左右)，每天观察培养皿表面有无微生物菌落。(3)涂层平板法分离土壤中放线菌取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，标明土壤稀释液稀释度(10-4、10-5 )、组、名称、操作日期等。 每稀释度做一个培养皿。 之后，将高粱1号培养基放入1520ml左右，冷却到50左右，将其冷凝成平板。从无菌吸引管中浓度最小的稀释液开始，每次0.1ml，加入对应编号(10-5 )的高氏1号平板(吸引前，吸引管在液体内吸引几次)，依次加入对应的平板中10-4的土壤稀释液。 用无菌刮棒(浓度小的稀释液)将放入平板培养基的土壤稀释液均匀地涂抹在平板表面整体。(4)平板刻划法分离土壤中的放线菌取下培养皿放在实验台上，用左手稍微打开培养皿，注入培养皿内溶解的营养固体培养基1012毫升，轻轻旋转培养皿，使培养基分布均匀，平整平整平整。 盘底用蜡笔划了a、b、c、d几个区。 一组两块平板培养基。用拇指和无名指将培养皿底部固定在倾斜状态，在火焰旁稍微打开培养皿。 与此同时，用环状接种针在火焰旁边采集浓度仅为10-2的土壤稀释液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边旋转67条第一次平行线，培养皿旋转约70角，用烧结过冷却的接种针在通过第一次线的部分画第二次平行线，用同样的方法画第三次平行线。 划线时，接种针应与平板表面成30角左右。 不要让接种针碰到培养皿边缘，也不要切培养基。(5)培养接种结束后，将平皿放入28的恒温槽中培养7天，观察平皿上的放线菌(主要是链球菌)的菌落。(6)选择蚁群3种方法的平板产生菌落后，鉴定微生物群，根据镜检结果判断是否分离为纯菌种。 菌种纯净时，可转移到坡面培养基进一步培养。 种植在斜面上，用牛皮纸包好菌种，放入4的冰箱保存。准备实验内容无菌刮棒打火机酒精灯无菌购物袋(1个) 99mL水/三角瓶(玻璃珠) 5根移液管9毫升水3根试管培养皿6套枪口(1mL/0.1mL )高氏一号培养基500 ml (2个200mL三角瓶、200mL试管)思考问题：1、检查接种后培养物的生长状况和染菌情况。2 .观察并记录下列内容：大小、形状、边缘颜色、表面代谢物的种类3 .放线菌和真菌，细菌如何区分？放线菌菌落小密，干燥，不透明，不易拾取。 大量孢子与菌落表面相接触，形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌落，由于基底内菌丝和孢子颜色多，菌落表里呈不同颜色。 霉菌的菌落应该比较大，可能又大又松散，又可能