土壤中放线菌的分离与纯化

土壤放线菌的分离纯化实验目的1 .掌握放线菌的生长特性和微生物的培养方法。2 .掌握微生物实验的基础生物技术，主要包括无菌操作技术、纯种分离技术、纯种培养技术和抗生素检测等。3.掌握合成培养基，选择培养基的制备方法。4.学会分析和解决微生物实验中的问题检验材料药物：可溶性淀粉、硝酸钾、氯化钠、磷酸氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁、琼脂、重铬酸钾其他：高压灭菌器、扭转天平、药勺、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸盐纸、细绳、无菌培养皿、铲子、抹刀、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中(主要是链霉菌)，其数量仅次于细菌。一般来说，它在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中较为丰富。由于土壤中的微生物是不同种类微生物的混合物，为了研究某种微生物，有必要将它们从这些混合微生物群中分离出来，以便获得某种菌株的纯培养物。稀释倒置板法是分离放线菌常用的方法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件的要求，通常选择合成培养基或有机氮培养基。如果改变培养基的组成，或者对土壤进行预处理(在120下热处理1小时)，或者添加一些抑制剂(例如添加几滴10%的苯酚等)。)，细菌和霉菌的数量可以大大减少，从而消除其他杂菌。通过稀释法，放线菌可以在固体培养基上形成单个菌落，获得纯菌株。放线菌可以产生抗生素并抑制其他菌株的生长，因此金黄色葡萄球菌(G)和大肠杆菌(G-)可以作为指示菌来鉴定放线菌。高的1号合成培养基是一种培养放线菌的培养基。这种培养基是由完全了解化学成分的纯试剂组成的。高1号培养基：碳源为可溶性淀粉，氮源为硝酸钾、氯化钠、K2HPO 43H2O，无机盐为硫酸镁7H2O，微生物微量元素为硫酸亚铁7H2O，提供铁离子等。1.1号合成培养基的制备K2HPO43H2O 0.125g克，可溶性淀粉5克，硝酸钾0.25克，硫酸镁7 H2O 0.125克，硫酸亚铁0.025克，氯化钠0.125克，琼脂5克，水250毫升。制备时，依次加入上述药物(琼脂除外)溶解，加入无菌水至250毫升，调节酸碱度至7.4，加入琼脂，继续搅拌摇匀至溶解，在121灭菌20分钟。消毒6套平板和12个试管。2.土壤放线菌的分离1.编号和分装：取6套无菌板，在板的底部贴上标签，并标明土壤稀释度(10-3，10-4，10-5)。每次稀释制作两个培养皿。然后将约15-20毫升溶解并浓缩至约50的高森1号培养基倒入每个培养皿中，然后浓缩成平板。试管架上还放置了另外五个含9毫升的试管和一个含10毫升无菌水的试管，并依次标有10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6。2.稀释、倾倒和分离按1g土壤样品，放入10毫升无菌水试管中，摇匀10分钟，即10-1份土壤悬浮液，静置30秒.取1毫升浓度为10-1的土壤悬浮液，用无菌吸管进行无菌操作，将其加入编号为10-2的无菌试管中，吹吸吸管2-3次，吸时伸入试管底部，吹时离开水面，使其混合均匀。即浓度为10-2的土壤稀释剂。以此类推，直到稀释到10-5管(每次稀释一个无菌移液管)。如图所示3.倒置平板分离培养将约10-15毫升融化后冷却至约45的高森培养基倒入装有不同稀释度菌液的培养皿中，将其置于水平位置，快速旋转并混合均匀，等待凝固。(如果融化的培养基温度太高，会产生太多的冷凝水，这会影响观察。)使用1毫升无菌移液管，分别准确吸取1毫升10-4、10-5和10-6的稀释细菌溶液，并将数字放入编号的无菌培养皿中，每个浓度对应两个平板。将添加到平板培养基中的土壤稀释液用无菌涂布棒均匀涂布在整个平板表面(从低浓度的液体开始)，涂布后用酒精灯对平板进行灭菌。稀释涂布板法4接种后，将平板和试管放入28的培养箱中培养7天，观察平板上放线菌(主要是链霉菌)的菌落。菌株纯化1.将加热熔化的1号合成培养基倒入一个平板中，并贴上标签。2.板材标号有许多划线方法，但是无论使用哪种划线方法，目的都是通过划线来稀释平板上的样品以形成单个菌落。有两种常见的划线方法：图五-3线分离示意图(1)用拇指和无名指通过隔板划线连接将培养皿底部以倾斜状态固定，培养皿在火焰旁边稍微张开。同时，用环形接种针用火焰刮去少许菌苔，在平板培养基的一侧第一次画出6-7条平行条纹，将培养皿旋转约70度，用烧过并冷却的接种针在第一条条纹部分画出第二条平行条纹(图v-3)，然后用同样的方法画出第三条平行条纹。标记时，接种针应与板表面形成约30的角度。不要让接种针接触培养皿边缘或切割培养基。划线完成后，盖上盘盖，在温室中倒置培养。(2)连续划线：在平板培养基上用选定的样品连续划线接种环(图v-4，b)。划线完成后，将培养皿盖好，在28下倒置培养。V-4划线分离示意图对抗实验在培养菌落后，有必要判断是否已经分离出纯菌株。1.配置鉴定培养基和金黄色葡萄球菌及大肠杆菌培养基。数字2在两块板上标记7个均匀分布的区域。2选择菌落，将生长较好的放线菌切割在纯培养板上，放在标记区域(用火焰切割)，放在28的恒温箱中1天，观察抑菌圈的形成。讨论1高雪培养基配置的关键是调节酸碱度和加入重铬酸钾。放线菌最适生长条件为2337，pH 7.0 7.5，在相同条件下，也有利于霉菌生长。在高温灭菌条件下，放线菌和霉菌的孢子仍能存活，因此必须加入重铬酸钾来抑制霉菌和细菌的生长(它对放线菌没有抑制作用)。否则，霉菌将大量生长。如图所示在制备培养基时，各组分的溶解顺序应该是先加入缓冲化合物，然后是主要元素和次要元素。调节酸碱度时，缓慢加入少量的酸和碱，并加入更多的搅拌，以防止局部的过酸或过碱损害营养。我们最初配置的高雪培养基可能由于酸碱调节过程中的过量酸碱和重铬酸钾的缺乏而失败。放线菌能产生色素，放线菌有几个代表性属。它的群体通常是圆形的，其致密的表面相对紧密、柔软或坚硬、干燥、有褶皱和地衣状。表面是干的。它可以作为鉴别菌株的基本参考。孢子菌在生长到一定阶段时会形成孢子。因为孢子含有不同的色素，成熟的孢子也显示特定的颜色，在一定条件下相对稳定，这也是鉴定菌株的基础之一。然而，孢子的形状和大小不能作为分类和鉴定的重要依据。整个过程应在无菌条件下进行，培养基和仪器可用高压蒸汽灭菌。接种时，用95%酒精擦拭实验台，接种时，应在火焰区的无菌范围内(空气中含有大量灰尘、细菌、霉菌孢子及其他污染)，打开培养基的时间应尽可能短。4稀释法和反板法要求涂层均匀，否则细菌滋生不均匀除了平坦涂层，划线法也用于稀释。涂布主要是通过稀释溶液来降低细菌的分布密度，