第六章+植物细胞培养.ppt

第六章植物细胞培养及次生代谢产物生产,培养过程：,培养物,外植体,愈伤组织,不定芽,根形成,愈伤组织诱导培养基,再分化培养基,生根培养基,植物细胞培养（PlantCellCulture）:在离体条件下，对植物单个细胞或小的细胞进行培养和继代培养，大量获得细胞群体的技术。,植物细胞分离方法,机械分离法：将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化优点：细胞不受酶伤害；有利于进行细胞的生理和生化研究。,酶解法:选择专一性水解酶在温和的条件下将植物细胞壁物质(纤维素、果胶、多糖)降解,从而使细胞彼此分开,获得单个细胞的方法。优点：可获得较多的游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。,植物细胞分离方法,愈伤悬浮法：从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团。优点：细胞不受伤害，可获得较多的游离细胞或小的细胞团。,植物细胞分离方法,第一节悬浮培养,细胞悬浮培养（Cellsuspensionculture)：将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行悬浮振荡培养，使其增殖的技术。,细胞悬浮培养技术,悬浮培养包括：愈伤组织的诱导;悬浮系的建立与细胞的生长增殖,(一)愈伤组织的诱导,适宜于细胞悬浮培养的愈伤组织要求：松散性好、增殖快、再生能力强。适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体适宜的培养基：适当的激素浓度；必要的附加物质多次继代筛选,外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。,适于悬浮培养适于再生植株,(一)愈伤组织的诱导,(二)悬浮系的建立与继代培养,成功的悬浮细胞培养体系满足三个条件：,均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。,悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在2050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。,细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。,悬浮细胞的生长动态,指,指,指,1、细胞计数：单位体积细胞浓度；2、细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占的体积；3、细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重,(三)悬浮培养过程中细胞生长情况分析测定方法,第二节单细胞培养（singlecellculture）,1、平板培养(platingculture)2、看护培养(nurseculture)3、微室培养(micro-chamberculture)4、双层滤纸培养(feederlayercultur),1、细胞平板培养,将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5105个/毫升植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为1-2mm左右。,细胞悬浮,过滤,与培养基混合,植板,培养,克隆愈伤组织,1、细胞平板培养,平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数植板率100%每个平板接种的细胞总数,1、细胞平板培养,优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。,Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。优点：简便易行，效果好。缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。,2、看护培养,3、微室培养,3、微室培养,优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。,把处理（如X射线处理）过的无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。,4、饲养层培养,第三节规模化细胞培养生产次级代谢产物,一、代谢产物(metabolites),初级代谢产物(Primarymetabolites)：生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。次级代谢产物(Secondarymetabolites)：是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。,二、植物次生产物的主要类型酚类化合物,包括黄酮类、醌类和简单酚类黄酮类：结构：C6-C3-C6生物合成前体：苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A。功效：为治理心血管疾病和高血压的药物成分。醌类化合物：结构：由苯式多环芳烃衍生的芳香二氧化合物，种类：苯醌、萘醌。功效：呈现颜色，具有抗菌、抗癌作用。,二、植物次生产物的主要类型萜类化合物,组成单元：异戊二烯种类：单萜、倍半萜、二萜、三萜以及甾类化合物。单萜和倍半萜是植物挥发油和香料的主要成分，有的具有重要的药用价值，如抗疟疾药物青蒿素（倍半萜类）。二萜生物碱：紫杉醇。三萜皂甙：人参皂甙。甾体皂甙：薯蓣皂甙。,二、植物次生产物的主要类型含氮化合物,包括生物碱、胺类、非蛋白质氨基酸和生氰苷，种类：5500种以上生物碱的作用：药用，植物抗毒素。目前对生物合成途径研究比较清楚的有：烟草的烟碱(nicotine)、毒藜碱(anabasine)和吡咯生物碱(pyrrolizidinealkaloid)，毛茛科植物的小檗碱(berberine)，曼陀罗属植物的莨菪碱(tropine)和东莨菪碱(scopolamine)。,二、植物细胞培养生产代谢产物的意义,例：紫杉醇（Taxol）是从红豆杉属植中分离得到的一种双萜类化合物。C47H51NO14，分子量：853.90用途：具有良好的抗癌活性，尤其对晚期、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有十分显著的疗效。制备途径：1.直接从红豆杉中提取；2化学全合成化学半合成；3.内生真菌培养；4植物细胞培养。,提取：在不同红豆杉属植物树种和树木的不同部位(如树皮、木材、树叶、嫩枝和幼苗等)含量有所不同，以树皮、嫩芽中含量最高，心材最低。一般含量为0.005%左右。生产1kg紫杉醇需要砍伐60年生大树3000-4000棵。若光从树皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。破坏宝贵资源、不可持续发展。化学合成：结构复杂，全合成需要几十步合成步骤，总得率仅4-5%。成本高,二、植物细胞培养生产代谢产物的意义,生产方式生产周期紫草素含量（干重）完整植物23年12植物细胞培养3周14,规模化细胞培养是生产植物次生代谢产物的理想途径。,二、植物细胞培养生产代谢产物的意义,植物次生代谢产品的市场潜能产品成分用途年销售额（亿美元）长春花碱治疗白血病1820（美国）奎宁治疗疟疾510（美国）致热素杀虫剂20（全世界）毛地黄心脏病药2055（美国）,三、规模化细胞培养,(一)植物细胞特点,Q.植物细胞与微生物细胞相比有些什么特点？,1、细胞本身的特性,细胞体积比微生物细胞大（10200m），是微生物细胞的30100倍；植物细胞生长速度慢；植物具大液泡和细胞壁，易受机械剪切力的影响；细胞常以非均相细胞团的方式生长。,2、植物细胞的培养特性,细胞培养中易结团，造成粘附、贴壁，影响细胞的正常生长；细胞培养过程中易产生黏多糖等物质，导致黏度增大，降低传氧速度；植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难；植物细胞培养一般需要光照；通过光合作用于合成有机物，因此CO2、O2含量与传递对细胞培养影响较大,（二）植物细胞规模化培养过程,1、细胞株（种子细胞）的选择2、筛选细胞株的增殖与放大培养3、大规模培养体系的建立生物反应器培养,细胞株（CellStrain),细胞系(Cellline)：经继代培养纯化，获得的以一种细胞为主的能在体外长期生存的不均一的细胞群体。细胞株(Cellstrain)：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法由单胞系增殖形成的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群。,1、细胞株的诱导与筛选诱导,愈伤组织的诱导与培养单细胞的分离细胞无性系的分离细胞株的筛选,1、细胞株的诱导与筛选筛选,（1）分散性好，适合大规模悬浮培养；（2）均一性好，细胞大小、生理状态一致；（3）生长速度快，培养周期短，不易染菌；（4）目标产物含量高，容易分离提取；（5）细胞遗传稳定。,适合大规模培养的细胞株应具备何条件？,单细胞培养法,1、细胞株的诱导与筛选筛选,2、筛选细胞株的增殖培养,悬浮培养（摇瓶培养），逐级放大，获得大量的活跃生长的种子细胞群体；细胞株鉴定：经常鉴定，防止细胞株退化和变异。,3、大规模细胞培养生物反应器培养技术,植物细胞大规模培养方式：（1）成批培养：在一个培养体积中接种细胞或添加培养基后，中途不添加也不更换培养基的方式。（2）连续培养：在培养过程中，不断向反应器中以一定流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中取出培养基的方式。(3)半连续培养：在完成成批培养的一个周期后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的方式。,（1）生物反应器的类型及特点,悬浮培养系统生物反应器固定化培养系系统生物反应器,悬浮培养生物反应器系统,机械搅拌式气升搅拌式鼓泡式,机械搅拌式生物反应器,机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计。,搅拌装置要减少剪切，改叶轮式为螺旋式；,因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；,由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；,为便于取样观察，一般还设计有取样口。,气升式生物反应器,气升式生物反应器：优点：供氧剪切力小，对细胞损伤小，易长期无菌培养。缺点：操作弹性小，低气速或培养后期混合效果差；此时如果提高通气量又会产生大量泡沫。,5L气升式植物细胞（或器官）培养罐,气升循环式生物反应器,内环式,外环式,鼓泡式生物反应器,悬浮培养生物反应器系统的比较,类型溶氧性破坏性混合度限制因素机械搅拌式中强较均匀细胞浓度高时混合不匀气升搅拌式高低均匀细胞浓度高时有死角鼓泡式中低不均匀有死角，发生细胞沉降,细胞固定化：指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态，进行无菌培养的一种技术。,固定化反应器,固定化培养的优点：,可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；,细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；,由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；,正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。,固定化细胞培养的条件,选用固定化细胞培养应具有如下两个条件：目的产物应自然分泌到培养液中，或者通过改变PH值、离子强度或使用渗透剂使之分泌于培养基中；要求产物的形成在细胞生长之后。,产物积累与细胞生长关系,生长偶联型中间型非生长偶联型,细胞固定化方法,常用的包埋固定方法：（1）海藻酸盐固定化滴入CaCl2使海藻酸盐形成颗粒（2）卡拉胶固定化滴入NaCl使卡拉胶形成颗粒（3）琼脂糖固定化（4）琼脂固定化,海藻酸钙固定植物细胞的技术路线：大量培养植物细胞混合倒入塑料注射器慢慢滴入含氯化钙培养基一定浓度的海藻酸钠溶液海藻酸钙固定的细胞团,小规模固定化小规模的植物细胞固定化可用无菌的塑料注射器进行。配制一定浓度的海藻酸钠溶液，高温、高压灭菌。通过离心或过滤收集植物细胞，将细胞悬浮于海藻酸钠溶液混合，倒入塑料注射器中，慢慢滴入到含有CaCl2的培养基中，不断搅拌，使之形成球形颗粒，然后通过过滤收集颗粒，用含有CaCl2的培养基清洗后，转入装有培养基的摇瓶中进行培养。,大规模植物细胞固定化装置,大规模固定化植物细胞需要采用大规模细胞固定化装置进行细胞的固定化。,细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：,包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；,附着式固定化培养系统：支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。,细胞固定化培养方式,常见的几种植物固定化生物反应器系统,流化床生物反应器：细胞包裹在胶粒、金属或泡沫颗粒中。优点：细胞包埋颗粒小，传质效率高。缺点：剪切力或碰撞破坏细胞。,（b）,空气出口,空气进口,流化床生物反应器,培养基,常见的几种植物固定化生物反应器系统,填充床生物反应器：细胞固定在胶粒、金属或泡沫颗粒或连续多个网中，或位于支持物表面。细胞固定不动。,（a）,出口,进口,填充床生物反应器,优点：单位体积固定细胞量大缺点：混合效果低，对必要的氧传递、PH、温度控制和气体产物的排除造成了困难，影响了细胞的培养，同时大颗粒的低效率传质、填充体成分供应和排除的困难,常见的几种植物固定化生物反应器系统,附着式固定化培养系统膜生物反应器常用中空纤维和螺线式卷绕反应器。缺点：传质效率低、易阻塞，产物收获较困难，投资大。,膜反应器的优点是可以重复使用，因此，尽管投资较大，仍较经济。另外，由于植物细胞代谢不像微生物那样旺盛，因而可以采用更厚的细胞层。,细胞,细胞,营养物入口,营养物入口,营养物出口,营养物出口,营养物质,a-中空纤维反应器,b-螺线式卷绕反应器,四、提高天然产物代谢技术,1977年Zenk提出：(1)维持培养基(maintenancemedia)尽可能快的使细胞量增长(2)生产培养基(productionmedia)诱发和保持次生代谢旺盛，积累相应代谢产物,1、两步培养技术,培养基既要满足植物细胞的生物量增长，还要满足细胞合成及积累次生产物的需要。,应用淀粉、琼脂、琼脂糖、藻酸钠、聚丙烯酰胺等作载体，将细胞固定在珠状胶囊或各种形状的支持物上。,2、固定化培养技术,在培养体系中加入脂溶性有机物，或是具有吸附作用的多聚化合物（如大孔树脂等），使培养体系形成上、下两相，细胞在水相中生长和合成次生物质，次生物质分泌出来转到有机相中。,3、两相培养技术,两相培养,组成：培养相和提取相组成类型：液-液系统和液-固系统液-液系统：分离相主要使用液体石蜡、烷类化合物。分离相和培养基的化学性质和比重不同。液-固系统：是指提取相以固态形式存在于系统中，主要通过吸附分离目的产物，目前使用的主要有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝以及树脂。,红豆杉细胞两相培养生产紫杉醇,实验材料：东北红豆杉细胞系培养基：第一相：B5培养基，第二相：5(v/v)的松油醇，产物释放剂：5(v/v)二甲基亚砜。接种量:10g(鲜重)/100ml培养基/250mL三角烧瓶。培养条件：25，120rpm，黑暗培养。,细胞干重；紫杉醇产量；两相系统；单相系统,第二相的加入，使得紫杉醇产量提高到30.19mg/L，比对照增加103%；63的紫杉醇从胞内的释放出来，其中有75转移至有机相。,a添加的有机物无毒害作用b产物溶于有机物或被其吸收c两相易分离，有利于产物回收d有