植物组织培养设备及条件.ppt

第二章实验室设计和培养条件,第一节实验室设计及基本技术第二节植物组织培养所要求的环境条件,第一节实验室设计及基本技术,一、实验室组成二、仪器设备三、培养器皿及实验用具四、洗涤技术五、灭菌技术六、无菌操作,组织培养实验室布局的总体要求便于隔离便于操作便于灭菌便于观察,一、实验室组成,基本实验室,辅助实验室,实验室组成,准备室缓冲室无菌操作室培养室,细胞生物学实验室温室生化分析实验室,组织培养准备实验室,准备室,缓冲室,无菌室,无菌室,培养室,培养架,培养间,二、仪器设备,1）、基本仪器设备冰箱、电（磁）炉、酸度计、纯水器、天平、移液器、解剖镜、光照培养箱、摇床、生化培养箱、培养基分装器、搅拌器等。,冰箱,酸度计,电炉,天平,纯水器,培养基分装器,搅拌器,摇床,体式显微镜倒置显微镜冷光源电磁搅拌器摇床,2）、灭菌设备蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。,蒸汽压力灭菌锅,高压灭菌器,干热消毒柜,75%酒精喷雾器,喷雾消毒器,3）、无菌操作设备,超净工作台,二、设备、仪器,超净工作台,（一）设备,1.紫外线灭菌灯2.日光灯3.工作台4.凳子5.搁物架6.窗7.推拉门8.缓冲间,无菌接种箱,4、细胞培养设备,摇床,培养架,HZC-250恒温振荡培养箱,150C250D光照培养箱,光照培养箱,烘箱,5、细胞学鉴定设备光学显微镜、体视显微镜、倒置显微镜,倒置显微镜,光学显微镜,电子天平（0.0001g，0.001g）,酸度计,1、玻璃器皿,三、培养器皿及实验用具,培养皿,三角瓶,培养瓶,2、金属材质用具,镊子,解剖刀,接种针,（二）各类器皿1器皿的类型（1）培养器皿三角瓶、培养瓶、圆形培养瓶、试管、L形管和T形管（2）分注器（3）刻度移液管（4）微量移液器（5）细菌过滤器,（三）器械用具打孔器镊子解剖刀接种针剪刀电热灭菌器,四、洗涤技术,2、塑料用品洗涤,3、金属用品洗涤,热洗衣粉水洗净,冲洗,擦干,五、灭菌技术,物理方法：干热、湿热、射线处理、过滤除菌等化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌,1、灭菌方法,2、灭菌,（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法压力在0.1M0.2MPa温度在121灭菌1030min（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌干热消毒灭菌,饱和蒸汽压力与其对应的温度,（3）塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用,（5）接种室灭菌,空气消毒灭菌,接种室,超净工作台,紫外灯照射,70%75%的酒精擦洗,培养材料的接种,紫外灯照射,（6）外植体灭菌,流水冲洗1020min或更长时间,70%75%酒精中浸泡30s,0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右,蒸馏水冲洗45次,在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右,备用,常用消毒剂消毒灭菌比较表,消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。开启过滤风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。用70%75%的酒精擦拭工作台和双手。,（7）接种准备,六、无菌操作,实验员消毒,实验室、无菌台灭菌,实验器材的灭菌,无菌接种,消毒,实验台卫生,培养室培养,植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的，要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。准备室：器具的洗涤、干燥、保存、灭菌，各种药品的储备、称量、溶解、配制、培养基分装等，设备：药品柜、防尘厨、冰箱、天平、纯水仪、酸度计、操作台、灭菌锅、烘箱。实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。化学室/准备室、接种室、培养室。,小结,接种室：植物材料的消毒、接种、培养物转移、试管苗继代、原生质体制备及其它需要进行的无菌操作。设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（镊子、剪刀、解剖刀、接种针）。清洁和消毒，减少与外界空气对流，穿实验服及换鞋以减少带入杂菌。培养室：墙壁要求绝热防火的性能，培养架由金属制成，底层离地高约10cm，层间隔40cm，总高1.7m左右，长度根据日光灯的长度而设计，宽度为60cm。,第二节植物组织培养所需的环境条件及营养成分,一、环境条件,与自然条件一样，组织培养中的外植体的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同培养基组成、pH值、渗透压等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需要来控制培养条件是组织培养中的一个重要问题。,温度在20-27左右，空调控温，湿度恒定，相对湿度在70-80%，光照由定时开关控制，每天光照10-16h左右，不同植物决定光照时间，培养室可采用太阳光为能源，易成活，阴雨天用室内灯光补光。,二、营养成分,植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡点等化学方面的作用；d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。,Arnon和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元素的3个标准:,A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史;B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复;C、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的变化而产生的间接效果。,国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。,根据植物体内含量多少，可把这些元素分为大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下，有的只含0.1mg/kg，Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种,按照国际植物生理协会的建议：所需浓度0.5mmol/L的元素为大量元素所需浓度0.5mmol/L的元素为微量元素,1、大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。P是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4、NaH2PO4等。K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。,Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。,2、微量元素在微量元素中，铁的使用最大：一些氧化酶的组成成分叶绿素形成的必要条件使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀,硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长锰参与植物的光合、呼吸代谢钼参与氮素的代谢氯是光合作用水光解的活化剂微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。,组织培养的条件营养条件（培养基），组织培养的重要基质，不同植物的组织对营养有不同的要求，合适培养基才能成功。MS培养基：1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞设计，无机盐浓度较高，硝酸盐含量高，用于植物器官、花药、细胞的组培，有些培养基是由它演变而来。B5培养基：1968年由Galmborg为培养大豆根细胞设计，含有较低的铵盐，适合双子叶植物、木本植物,White培养基：1943年由White为培养番茄根尖设计，MgSO4、硼盐浓度高，无机盐浓度低，适于生根培养。N6培养基：1974年由朱至清为禾谷类花药培养而设计，KNO3和（NH4）2SO4浓度高，适于花药培养。KM-8P培养基：1974年为原生质体培养而设计，有机成分复杂，包括了所有的单糖及维生素，适于原生质体融合培养。,培养基成分主要是水、无机盐、有机物、天然复合物、培养基中的凝胶无机盐：大量元素（大于0.5mmol/L的元素）、微量元素。N：是蛋白、维生素、核酸、磷脂等的组成成分，培养基中有NO3-、NH4+供应形式，如KNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4等。P：磷脂、ATP等的组成成分，常用的有KH2PO4、NaH2PO4等K：与糖类合成、蛋白代谢有关，常以KCL、KNO3在培养基中提供Mg、S、Ca：是叶绿素、酶、细胞壁的组成成分，MgSO47H2O、CaCL27H2O,微量元素：小于0.5mmol/L，Fe、Zn、B、Mn、Cu、Mo、Co等；FeSO47H2O与Na2-EDTA配成铁盐溶液。碳水化合物：常用的是蔗糖、葡萄糖，常用浓度为3%。维生素：以辅酶的形式参与多种代谢，对生长、分化有促进作用，VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、VB12、VPP（烟酸）、VC（抗坏血酸）、生物素、叶酸。肌醇：环己六醇，参与细胞壁、细胞膜构建，100mg/L,氨基酸-有机氮源，细胞直接吸收，甘氨酸、天冬氨酸、谷酰胺、水解乳蛋白（氨基酸混合物）等，10-1000mg/L天然复合物-椰子乳、香蕉、马铃薯滤液、酵母提取液、麦芽提取液、番茄汁等，不易培养时使用。植物激素-培养基的关键物质，生长素类（IAA、NAA、IBA、2,4-D；细胞分裂素（6-BA、KT、ZT）；赤霉素（GA3）生长素/细胞分裂素：高利于根、愈伤组织形成；适中利于根、芽分化；低利于芽的形成,培养基的支持物琼脂（固体培养时的固化剂，低于40度为凝胶，6-10g/L），玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是降低培养材料产生的有害物影响抗生素-卡那霉素、头孢、青霉素、链霉素、庆大霉素等，5-20mg/L，防止菌类污染。活性炭-吸附培养基中的杂质、酚、醌类、灭菌副产物等，0.5-10g/L,缺铁症状：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势发展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。,桃树,缺铜症状：新梢顶端叶片的叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点，扩大变成深褐色，引起落叶。枝顶端生长不良，下部的芽开始生长，形成丛生的细枝。,菊花,缺锰症状：叶脉间失绿褪色，但叶脉仍保持绿色，脉间出现坏死斑，缺素症状由幼叶开始。,菜豆,梨缺锰症,缺钼症状：叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。,白菜,缺硼症状：受精不良，籽粒减少，“花而不实”，“蕾而不花”；根尖、茎尖的生长点停止生长，而形成簇生状；常引起各种腐烂病。,马铃薯,缺锌症状：小叶病，叶片变小，两节之间缩短。叶脉间失去