遗传学医用 (12).ppt

1、第10章基因诊断genediagnosischinamedicaluniversitydepartmentofmedicalgenetics，p480，2， 本章基因诊断概念基因诊断方法直接诊断(Southern )间接诊断(PCR-RFLP)DNA多态性基因诊断例： 3第一节基因诊断技术第二节基因诊断方法和实例，4、基因诊断：利用分子生物学技术从DNA水平检测人类基因疾病的基因缺陷，也称为DNA分析法。 传统诊断：表型基因型基因诊断：基因型表型(反向诊断)，5，基因诊断特点：1不受材料来源影响的外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等2种症状前诊断，特别是一些迟发性疾病，Huntingtong舞蹈病3产前诊断，避免患儿出生，提高人口质量，6， 第1节基因诊断技术、Southern印迹杂交7、基因诊断技术、北印迹杂交8、基因诊断技术、斑点杂交11、基因诊断技术、聚合酶链反应12、基因诊断技术、聚合酶链反应13、基因诊断技术、多重PCR在一个PCR系统中使用数个PCR引物为了检测独占领域不重复的同一基因的多个外显子的缺失，14，基因诊断技术，RT-PCR， 以mRNA为模板的逆转录酶合成的cDNA研究基因表达快速扩增微量mRNA，提高mRNA检测灵敏度15，基因诊断技术，单链DNA为碱基序列的因此，可以用于DNA的单一碱基的替代、微小的缺失和插入的检测。 16、基因诊断技术、-32 p-dntp PCR扩增产物改性单链DNA中性聚丙烯酰胺凝胶电泳12345自显影1分析为正常结果，2、4、5分析为纯合患者3为杂合子.，17，基因诊断技术，生物芯片，18，第二节基因诊断方法和实例， 直接诊断直接检测病原基因突变基因突变型的缺失、点突变、重复、插入等，间接诊断3354将DNA多态性作为基因标记进行连锁分析，确定受试者是否获得病原染色体，由此间接诊断DNA多态性RFLP、VNTR、SNP、SNP DNA多态性、DNA多态性(DNAPolymorphism ) :诊断群体中各个DNA区存在2种以上等位基因(或片段)，对基因功能无影响，称DNA多态性。 以孟德尔方式遗传。 经常做遗传分析的标志。 20，DNA分析中常用的遗传多态性标记有3种：1)RFLP :被称为限制性片段多态性，第一代多态性标记2 )重复序列多态性(VNTR ) :短序列重复序列(STR )，第二代多态性标记3 )单核苷酸多态性(SNP):DNA序列的单核苷酸21，1 )限制片段多态性，restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP可能因碱基变异而导致限制酶切点消失或出现新的酶切点，因此不同个体DNA用相同限制酶切时，不同长度的DNA 22、AlleleII产生了新的酶切点，AlleleI、AlleleII、12Kb、8Kb、4Kb、probe、12Kb、8Kb、RFLPSouthernblot检测结果显示，23、AlleleII酶切点消失，24、2 ) 数变异反复串联，variablenumbertandemrepeats，VNTR )，重复排列在各自的核心排列(重复单位)上，首尾被反复多次，称为串联重复排列，其重复次数在人群中变异，形成多态性的VNTR。 散布在染色体上。 重复单元为625bp的长度，称为小卫星DNA。 重复单元2到26bp的长度被称为微卫星DNA，例如，(TA)n，(CGG)n。 25，VNTR两侧的酶切点是固定的，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后会产生不同长度的片段。DNA多态性可通过PCR扩增后的电泳检测，扩增片段多态性(amplefieffdragmentlengthpolymorphism，Amp-FLP )、26、VNTR酶切、电泳后的检测结果：，大，小，小PCR-VNTR，29，30，3 )单核苷酸多态性(SNP ) (单核苷酸多态性)，SNP :根据基因组中一个碱基的替代或SNP在基因中的位置，基因编码区域SNP基因周围的SNP基因间的SNP在人类基因组中为100 通常使用基因本身或邻近的DNA序列作为探针，进行southern杂交，用PCR扩增产物，检测基因点的突变、缺失、插入等异常和性质。 主要适用于已知基因异常疾病的诊断。 直接基因诊断和实例，32，直接基因诊断突变型遗传病直接基因诊断，e.g .巨细胞贫血的Gene诊断，33，1 ) southern blot珠蛋白链基因的第6位密码子突变GAGGTG谷Aa巴尔Aa，e.g .巨细胞贫血的gag 限制酶Mst1识别序列(cctnagg)cctgtgtgtgg突变后无法识别，已知酶切部位消失，酶切长度变化。 已知、35、2)aso探针诊断、突变Gene位点和性质，合成寡核苷酸探针、32P标记，进行斑点杂交。 正规gene probe 和正常Probe杂交稳定MutationSGeneProbe和异常S杂交稳定，36，等位基因特异性寡核苷酸探针(aso ) (allele-specific-oligo nucleotide ) /ss/s正常探针突变探针，BamHI，BamHI，2，1，2，10kb，probe，1 )地中海贫血的基因诊断，基因程度的不同会引起不同类型的地中海贫血。 直接基因诊断-缺失型遗传病的直接基因诊断，40，Southernblot检查结果：/-/-/-正常缺失1缺失2缺失3缺失4，14kb，10kb，缺失型遗传病的直接基因诊断，41， 2)地贫的Gene在珠蛋白基因两侧有pst1酶切点的pst1酶切正常获得4.4kb片段的珠蛋白基因缺损0.7kb片段，pst1酶切3.7kb片段为0，缺损型遗传病直接基因诊断，探针42，Gene，southern /A/00/0，4.4kb，3.7kb，缺失型基因直接基因诊断43，3)DMD基因诊断，DMD属XRDMD基因是最大的基因，79个外显子DMD基因突变主要以缺失为主，可与基因的不同部位相关缺失型遗传病的直接基因诊断，44，病例，外显子，12345678，Pm34350136476052，bp，535，113，缺失型遗传病的直接遗传基因诊断，45，2 )间接遗传基因诊断方法和实例，在病原遗传基因已知但其异常性质未知或疾病Gene本身未知的情况下，主要通过Gene和DNA多态性的连锁分析间接诊断46、连锁分析基于基因标记和Gene在染色体上连锁，通过对受试者及其家系进行连锁分析，分析后代是否获得了某基因标记与疾病的关系，间接地推断受试者世代是否获得了具有病原基因的染色体，间接地判断和诊断。 遗传标记为基因组中的DNA多态性： RFLP、VNTR等。 间接基因诊断，47，遗传标记，相关基因，表型分析，间接基因诊断，48，1 southern blot- RFLP诊断(PKU )，PAH基因两侧有Msp1酶切位点，用该酶消化可产生2种对立片段，即23kb，19kb，PAH 间接基因诊断，49，患者为19kb片段纯合子，患者缺陷的PAH基因和19kb片段与父亲、母亲缺陷的PAH基因和19kb片段相连，其23kb片段与正常PAH基因相连。 II2为23kb和19kb片段的杂交种，是表型正常的病原基因携带者。间接基因诊断，50，2成人型多囊肾病诊断，例：成人型多囊肾病APKD，AD，临床表现为腰痛、蛋白尿、血尿、高血压、肾盂性肾炎、肾结石。 最终导致肾功能衰竭和尿毒症。 虽然APKDGene定位于16p13，但病原基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机制尚不清楚，但证实APKDGene与珠蛋白基因的3 末端附近的小卫星DNA序列(3HVR )紧密连锁间接基因诊断，以51，3 hvr为探针，PvuII酶切除后家系成员的基因组DNA为SouthernBlot，基因组DNA，PvuII酶切除，DNA片段，改性，转染，探针，改性，杂交，结果分析，间接基因诊断，52， 1212345255.7kb3.4kb2.3kb，间接基因诊断，53，结果分析表明，患者(I1，II1和II2 )有3.4kb的片段，致病基因和3.4kb的片段连锁，以孟德尔方式遗传II5不含3.4kb片段，产前诊断正常。 间接基因诊断，54，3 a型血友病诊断(PCRRFLP )，a型血友病的基因诊断：已知a型血友病XR，获得家系成员的基因组DNA。 PCR142bpBcLI142bp99bp43bp的电泳结果分析：p1，p 2，142bp，99bp，43bp，BclI，BclI，BclI，间接基因诊断，55，间接基因诊断，56，142bp，142 BP 3，I，ii，III，1，间接基因诊断，57，结果分析，1 )先证者II1有99bp片段发病，该片段来自母亲。 2)II2为142bp/99bp，为杂交种。 142bp来自父亲，是正常片段，99bp片段来自母亲成为携带者。 3)iii1为99bp片段，男性为患者(99bp片段来自母亲)。 女性需要用携带者(父母双方)、间接基因诊断、58、单体型分析，有时一种酶和一个探针无法提供可分析的信息，一种以上酶结合一些基因探针进行杂交分析。 根据同一染色体上受限部位丧失或获得的一组多态性部位组成的不同片段长度组合类型进行分析，该分析方法为单体型分析(Haplotyping )，间接基因诊断，59例： PKU家系hindiii酶切：患儿4.2/4.0kb杂体双亲4.2/4.0kb杂体用sphi酶切片：患儿纯合7.0kb父亲纯合7.0kb母亲9.7kb和7.0kb杂合体，间接基因诊断，60，结果121234.2kb4.0kb11kb9.7kb7.0kb，hindiii，sphi间接基因诊断，61，分析：患儿ii1是母亲和父亲分别获得7.0kb突变型的Hind酶切结果，正常同胞ii3纯合4.0kb，为sph7.0kb的纯合体，母亲H4.0kbS7.0kb构成单体型，母亲4.0kb 间接基因诊断62，患儿ii1为hindiii4.2/4.0kb杂合