第八章 酶免疫技术.ppt

免疫学检验,讲师卫生检验系025-8686293813921433351wuqian,第一节酶免疫技术的原理第二节酶免疫技术的分类第三节酶联免疫吸附试验第四节固相酶免疫测定的技术要点第五节酶免疫组织化学技术第六节其他酶免疫技术第七节酶免疫测定的应用,第八章酶免疫技术,第一节酶免疫技术的原理,主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标物特点：免疫学活性酶对底物的催化活性,抗原抗体反应的特异性,+,酶促催化反应的高敏感性,原理及特点,特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。,原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,原理及特点,第二节酶免疫技术分类,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均相,异相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,组织切片中的抗原抗体反应,液体标本中抗原或抗体的定性和定量,(ELISA),用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定,酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。Ag+Ab-EAg-Ab-E+?,原理,一、均相酶免疫测定,最具代表性的两种技术,酶放大免疫测定技术EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique,克隆酶供体免疫分析CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay,均相酶免疫测定,EMIT示意图,CEDIA示意图,分类：液相酶免疫测定固相酶免疫测定以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前最为常用的固相酶免疫测定,与均相不同之处,需分离游离与结合的酶标记物,二、异相酶免疫测定,第三节酶联免疫吸附试验,三个部分：免疫反应酶与底物反应检测方法的建立,ELISA,酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）,高纯度的抗原、高亲和力的抗体高活性、高纯度的标记用酶有效的交联方法制备高质量的酶标记物选用适宜的酶/底物系统分离结合与游离标记物的方法建立操作步骤以及研究自动化测定技术,底物显色定性或定量的分析,原理,包被,反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体,洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离,1,2,3,4,一、基本原理,固相的抗原或抗体,酶标记物,酶反应的底物,三个必要试剂,二、方法类型及反应原理,双抗体夹心法（doubleantibodysandwich-ELISA）方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定(乙型肝炎表面抗原HBsAg),不能用于半抗原等小分子的测定。,ELISA检测抗原的方法,1、已知抗体包被于载体表面,3、加酶标抗体与抗原结合,4、加酶作用的底物产生颜色,2、加待检物抗原与抗体结合,4、加酶作用的底物不产生颜色,双抗体夹心法测抗原,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待检物无抗原与抗体结合,3、加酶标抗体无抗原结合,+,-,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,ELISA检测抗体的方法,捕获法原理：抗人IgM链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体底物显色,应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体甲型肝炎HAV-IgM抗体乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体,捕获法原理,+,-,1、固相化抗人IgM,1、固相化抗人IgM,2、加待测物特异性IgM与非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，与特异性抗体结合,4、加酶标抗体与特异性抗原结合，加底物显色,2、加待测物只有非特异性IgM和抗人IgM结合,3、加特异性抗原，不能与非特异性IgM结合,4、加酶标抗体无抗原结合，加底物不显色,第四节固相酶免疫测定的技术要点,试剂的准备反应条件的选择操作的标准化,一、试剂的准备,（一）固相载体聚苯乙烯特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性形状：小试管、小珠、微量ELISA板使用前检测其性能（二）抗原和抗体高纯度的Ag高效价的Ab,一、试剂的准备,（三）酶和底物的选择标记酶的要求：活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉,辣根过氧化物酶（HRP）,糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关辅基是酶的活性中心,RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比,RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要,ELISA中应用最为广泛的标记用酶,常用酶,HRP的底物,DH2+H2O2D+2H2O,HRP,供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种,H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高（小分子醇和尿素的过氧化物）,常用底物,HRP的常见底物,邻苯二胺OPD,四甲基联苯胺TMB,5-氨基水杨酸5-ASA,2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐ABTS,常用底物,OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。,TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,HRP的常见底物,碱性磷酸酶（ALP）,菌源性ALP肠粘膜ALP(小牛),半乳糖苷酶（-Gal）,常用酶,大肠埃希氏菌,ALP的底物,-Gal的底物,对-硝基苯磷酸酯（pNPP）,4-甲基伞酮基-D半-乳糖苷（4MUG）,经ALP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。,酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。,常用底物,二、酶标记抗体或抗原的方法,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物（conjugate）酶标记物,通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物,抗原要求纯度高，抗原性完整,抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。,制备方法要求,制备方法,过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原,戊二醛交联法,戊二醛交联法,戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。,纯化,标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度,常用的纯化方法：葡聚糖凝胶（Sephadex）G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯亲和层析效果更好（SPA-IgG;ConA-HRP）,二、酶标记物的纯化和鉴定,鉴定,质量鉴定（ELISA法直接测定）,HRP标记IgG的酶标记率（戊二醛法）酶结合量（mg/ml）IgG量（mg/ml）HRP/IgG摩尔比酶的标记率,四、最适工作浓度的选择(棋盘法),五、测定方法的标准化,包被加样洗涤孵育结果判定,理想coating：吸附尽可能多的Ag或Ab；吸附牢固；非特异性吸附较少包被机制1、物理性吸附（被动的）2、共价交联（戊二醛，标准化）影响包被的因素1、包被物质的性质及其浓度2、包被缓冲溶液的pH及离子强度3、包被温度和时间,包被物质的性质及其浓度聚苯乙烯吸附抗原效果好聚乙烯吸附抗体效果好浓度过高引起前带现象浓度过低引起非特异性吸附(BSA封闭)包被缓冲溶液的pH及离子强度相对低的离子强度有利于蛋白质分子吸附固相表面包被温度和时间置4冰箱过夜，或37孵育2h,加样加样量准确加样位置不产生气泡,洗涤目的1、洗去未结合的物质2、洗去非特异性吸附要求1、每孔充满液体2、去净洗涤液（Tween20）3、冲洗次数和浸泡时间足够4、具有传染性样品必须采用全自动冲洗,孵育定义：要使抗原抗体反应和酶催化反应顺利进行，需要合适的pH和适当离子强度的基质液，保持一定的温度，并作用一定时间，整个过程称为孵育或温育。方法：干式湿氏推荐温度：37增强作用:聚乙二醇反应时间:以阳性标本的吸光度值达到1.0时为反应终点,结果判定1、吸光度法（A）2、比例法(A/A0)3、滴度法（倍比稀释样品）4、吸光度直接表示阳性的程度（均一化）5、标准曲线法,第五节酶免疫组织化学技术,酶免疫组织化学技术(enzymeimmunohistochemistrytechnique),定义在一定条件下，应用酶标抗体或抗原与细胞或普通组织切片中抗原或抗体反应，酶与底物作用形成有色沉淀物或产物电子密度发生改变，在光镜和电镜下，就可识别出标本中抗原或抗体的分布和性质；经图像分析也可达到定量的目的。种类1、标记抗体免疫组织化学技术2、非标记抗体酶免疫组织化学技术3、酶标记免疫电镜技术,1、标记抗体免疫组织化学技术,第六节其他酶免疫技术,免疫印记法（immunoblottingtest）,其他酶免疫技术,生物素-亲和素（BSA）-酶联免疫吸附试验生物素（biotin）-亲和素（avidin）亲和素与生物素之间的亲和力极强，比抗原与抗体的亲和力至少高1万倍，且具有高度特异性和稳定性。,其他酶免疫技术,第七节酶免疫测定的应用,ELISA在预防医学、临床医学的应用病原体及其抗体的检测（乙肝两对半）蛋白质的检测非肽类激素的检测药物的检测尿中毒品的检测,酶免疫测定的应用,ELISA在食品检测中的应用食品中微生物的检测食品毒素的检测（黄曲霉毒素）食品中残留农药的检测（除草剂、杀菌剂和杀虫剂）食品中残留抗生素的检测（氯霉素、磺胺类、呋喃类、喹诺酮类）,酶免疫测定的应用,ELISA在转基因食品检测中的应用（PCR-ELISA方法）DNA检测蛋白质检测,酶免疫测定的应用,1酶免疫技术的要点？2酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？4常用的底物有哪几类？特点？5常用的酶有哪几类？特点？6何谓包被与封闭？其作用？7对酶免疫技术的应用评价如何？,思考题,酶免疫技术是标记免疫技术的一种，它是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫检测方法，在抗原与抗体的