基因工程 genetic engineering

基因工程geneticengineering,授课人：杨晶凡,一、基因工程的概念geneticengineering,定义：又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。目的:是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并能稳定遗传。,Goldenriceandnormal(white),InsectinfestationonBt(right)andnon-Bt(left)cottonbolls/programs/lifesciences/TransgenicCrops/images/cotton.jpg,2000年，法国科学家利用基因技术“制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba”。应用了受精卵显微注射技术，从水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后，使它的发光率比原先提高了两倍，再将该基因植入到了兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子Alba。在普通光线下，它看上去与其它同类没有区别，但是在较暗的光线下，它的身体就会放射出奇异的绿光来。,能发荧光的热带斑马鱼,普通热带斑马鱼是不发荧光的,2020/5/30,5,理论基础,不同基因具有相同的物质基础；基因是可切割的；基因是可以转移的；多肽和基因之间存在对应关系；遗传密码是通用的；基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。,2020/5/30,6,重要特征：1、可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状2、某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能,基因工程大事记,1973Cohen第一例成功的克隆实验1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物1982第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼,1993基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所多莉羊1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11公布人类基因组基本信息,基因工程的基本步骤可概括为：目的基因的获得(基因克隆)；分、切目的基因与载体连接(DNA分子重组)；接重组DNA分子导入受体；转转化子的筛选、鉴定。筛,基因工程技术路线,胰岛素原的人工合成,胰脏,(A)n胰岛素原mRNA,cDNA,重组质粒,转化细菌,mRNA,反转录酶,胰岛素原基因,与质粒连接,感染E.coli,胰岛素原,二、基因工程的酶学基础,限制性核酸内切酶DNA聚合酶逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶,限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。,1、限制性内切酶与DNA分子的切割,1953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。发现100-200个子代噬菌体中，只有1个可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。假设：限制性内切酶与修饰酶。,作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,分类：、类（基因工程技术中常用的是类）,型酶1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg+的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。许多型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。,类酶识别序列特点：回文结构(palindrome),识别序列的长度一般为4-8个碱基，常为6个。切口：平端切口、粘端切口。,核酸内切酶作用后的断裂方式：粘性末端：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,常用限制性内切酶种类及特性,同裂酶（isoschizomers)指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:限制酶Hpa和Msp是一对同裂酶(CCGG)，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时Hpa不能进行切割，而Msp可以。,同尾酶（isocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。杂种位点：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。,BamH,Bgl,+,+,影响核酸内切酶活性的因素：1.DNA的纯度：DNase的污染(Mg+)a.增加核酸内切限制酶的用量，b.扩大酶催化反应的体系（稀释），c.延长酶催化反应的保温时间。加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度。,2.DNA的甲基化程度3.酶切消化反应的温度：大多数酶的标准反应温度37度。4.DNA的分子结构：某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。,核酸内切限制酶标准的缓冲液1.氯化镁、氯化钠或氯化钾：不正确的NaCl或Mg+浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变。2.Tris-HCl：维持最适的pH值（pH7.4）。3.-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：维持酶的稳定性。4.牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。,核酸内切限制酶对DNA的消化作用1.核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用。2.核酸内切限制酶对DNA的局部消化完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平。局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的DNA消化完全，就可以获得平均分子量大小有所增加的限制片断产物，进行不完全的限制酶消化反应。a.缩短酶切的消化反应的保温时间b.降低反应的温度（37-4）结束酶的活性。,2、DNA连接酶与分子的体外连接,（1）DNA连接酶：能够将DNA链上彼此相邻的3-羟基（OH）和5-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。,DNA连接酶“分子缝合针”,作用：将双链的DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。,（2）种类：EcoliDNA连接酶从大肠杆菌中分离得到，只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。T4DNA连接酶从T4噬菌体中分离得到，既可“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。,T4DNA连接酶（DNAligase）该酶常从T噬菌体的受感细胞中提取。它可催化DNA中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。,（2）DNA分子的体外连接限制片断的末端连接作用分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。,粘性末端DAN片断的连接由于具粘性末端的载体易发生自连。对载体的5末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5-P能与载体的3-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5-P的链不能进行连接，形成3-OH和5-OH的缺口。,平末端DNA片断的连接1.T4DNA连接酶2.用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法,同聚物加尾法,用5末端特异的核酸外切酶处理DNA片断,在A和B分别中加入dATP和dTTP,同聚物尾巴1040个碱基,衔接物连接法平末端的另一种处理方式是利用衔接物进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10-20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。,衔接物连接法,体外连接的三种方式：1.用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断。2.用T4DNA连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用DNA连接酶连接。3.先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接。,3、其他工具酶,（1）大肠杆菌DNA聚合酶：具有聚合酶活性和3核酸外切酶活性，小亚基具有5核酸外切酶活性。主要用于标记DNA片段，例如，采用缺口平移技术制备分子杂交用的探针,5至3的聚合活性53方向核酸外切酶活性53外切酶活性35外切酶活性pol经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段（Klenow片段）：聚合活性、35外切活性常用的工具酶,（2）Klenow片断与DNA末端标记Klenow片断：是由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为761000dal的大片断分子。仍具有53的聚合酶活性和35的外切酶活性，失去了全酶的53外切酶活性。,Klenow片断的主要用途：1、修补经限制酶消化的DNA所形成的3隐蔽末端；2、标记DNA片断的末端；3、cDNA克隆的第二链cDNA的合成；4、DNA序列的测定。,（3）T4DNA聚合酶1、从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶。具有53的聚合酶活性和35的外切酶活性。2、在没有脱氧核苷三磷酸存在的情况下，3外切酶活性便是T4DNA聚合酶的独特功能。作用于双链DNA片断，并按35的方向从3-OH末端开始降解DNA。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。,（4）反转录酶：具有反转录酶活性和RNaseH活性。主要作用是以mRNA为模板合成cDNA；用来对5突出末端的DNA片断作末端标记。,（5）末端核苷酸转移酶该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶，它是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，能催化5脱氧核苷三磷酸进行53方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3-OHDNA片段为引物，在3-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3-OH末端的单链DNA,也可以是具有3-OH突出末端的双链DNA,（6）S1核酸酶：来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。,（8）碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌或小牛肠，该酶用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸根，使5-P成为5-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。,重组DNA技术中常用的工具酶,克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,三、基因工程中的载体,分类：克隆载体质粒入噬菌体粘性质粒M13噬菌体表达载体大肠杆菌表达载体哺乳动物表达载体,本质：DNA携带外源DNA进入受体细胞的运载工具。,质粒载体大肠杆菌质粒载体PBR322枯草杆菌质粒载体PNC3酵母菌质粒载体农杆菌Ti质粒载体Ti噬菌体载体噬菌体载体Cos噬菌体载体病毒载体SV40病毒载体乳头瘤病毒载体,1.质粒载体(plasmid),特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。,大肠杆菌的质粒,分子量相对较小，在细菌中稳定存在，拷贝指数高。具有遗传标记：如抗生素性基因半乳糖酶基因（LacZ）具有多个酶的单一切点。称多克隆位点如PBR322(人工合成)4.3Kb：含AmP(氨卞青霉素)、Tet(四环素)24个单一切点,质粒种类很多，但作为克隆载体须具备。,质粒携带外源基因,每个细胞中的质粒数目主要决定于质粒本身的复制特性，质粒能够随着细胞的自我复制而分配到后代中。按照复制性质，可以把质粒分为两类：严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1-2个质粒。松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每个细胞内一般有20左右质粒。,种类：F质粒：使宿主染色体上的基因通过性菌毛随其一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞中。R质粒：抗性因子，携有一种或多种抗生素抗性基因转移到原先不存在该质粒的受体细胞中。Col质粒：有编码大肠杆菌素基因,质粒的类型和特性,传递类型：接合型：含有自主转移基因，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。如：F质粒、部分R、Col质粒非接合型：不含有自主转移基因，质粒不能自主从一个细胞转移到另一个细胞。如：部分R、Col质粒（安全常用）特性：自主复制、转移、选择标记遗传特性、不相容性（同者相斥、异着共存）、分配功能（亲代子代）,常用的质粒载体pBR322质粒分别由pMB1(ori)、pSF2124(Ampr)和pSC101(Tetr)三种质粒通过载体改造后形成，使之具有松弛型ori和Ampr及Tetr两种抗性基因的理想的基因克隆载体。Ampr（Scal、PvuI、PstI切点）Tetr（EcoRI、Nhel、BamHI、SphI、HindIII切点）,pBR328是从pBR322改建成的质粒，大小为4.907kb,它具有Ampr、Tetr和Cmlr基因。Cmlr基因有EcoRI、Pvu和BalI的单一酶切位点。除了pBR328外，pBR325也有类似结构。Cmlr抗氯霉素基因,2、噬菌体载体噬菌体是一类细菌病毒的总称。在噬菌体DNA分子中，除具有复制起点外，还有编码外壳蛋白质的基因。,噬菌体的溶原周期和溶菌周期,溶菌性：在细菌中连续增殖直到细菌裂时，释放噬菌体。溶原性：将其DNA整入细菌中。只有双链DNA的噬菌体才具有溶原周期。,根据生活周期可分为：,特点双链DNA分子（线性或环形）两端具有12个nt单链互补粘性末端具非必需区（中间区约1/3长度）可在E.Coli中大量繁殖可克隆15Kb左右的外源基因,（2）噬菌体载体,DNA为线状双链分子，两端各有12个碱基的单链互补粘性末端，通过粘性末端的互补作用形成双链环形DNA。这种由粘末端结合形成的双链区段即Cos位点。噬菌体的类型：插入型载体替换型载体,插入型载体：外源DNA克隆到分子上，使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即插入失活效应。如：半乳糖酶失活的插入型载体（蓝白筛选）,C：若LacZ基因被外源DNA插入而破坏，则不能制造半乳糖苷酶，菌落为无色（白色）。,B：在含X-gal的培养基中，在Lac操纵子诱导物IPTG（异丙硫半乳糖苷）作用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X-gal，此菌落为蓝色。,A:载体中含一个LacZ基因半乳糖苷酶X-gal(无色)X(蓝色)+gal(半乳糖)*其中X为有色基团：（4-溴-5-氯吲哚）与gal结合成无色的X-gal,Blue/WhiteSelection,Bacteriaplusemptyplasmid,Onlycoloniesfrombacteriathathaveplasmid,NutrientmediaplusantibioticplusX-Gal,Bacteriawithplasmidplusinsert,2020/5/30,80,Colonieswithinsert-whiteColoniesw/oinsert-blue,取代型载体（又叫替换型载体）在DNA分子的中央，插入一段DNA片段：具有多克隆位点的反向重复序列当外源DNA插入时其可被置换掉作用：提高了克隆外源DNA的能力。,3.粘性质粒（Cosmid）带有噬菌体的Cos位点和整个pBR322的DNA顺序。经感染进入细菌细胞以后，它就好象质粒那样在细胞中进行复制。易环化和扩增。分子量小，可包装30-45kb外源基因，可由Ampr抗性筛选，常用于构建基因文库。,cos:cohesive-endsite,在酵母细胞中克隆基因常用的载体1.整合型载体（YIP）2.复制型载体（YRP）3.附加体型载体（YEP）,在酵母细胞中常用的载体的共同特点:（1）能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增；（2）含有在酵母中便于选择的遗传标记。这些标记一般能和大肠杆菌相应的突变体互补，如Leu2+、His+、Ura3+、Trpl+等。有些还携带用于大肠杆菌的抗菌素抗性标记；（3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。,整合型载体（YIP）,YIP型载体是由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片段构成的。如Pyeleu10是由ColEI质粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段构成，在细菌中复制、扩增，进入酵母后可整合表达。YIP型载体的特点是转化率低(只有1-10转化子/微克DNA)，但转化子遗传性稳定稳定，多用于遗传分析工作。,复制型载体（YRP）,YRP型载体是带有选择标记和复制子的酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的。因为它同时含有大肠杆菌和酵母的自主复制基因，所以能在两种细胞中存在和复制。可以在两种截然不同的生物细胞中复制的载体称为穿梭载体，穿梭载体在基因工程中广泛使用。YRP型载体转化率高，拷贝也高，但不稳定，易丢失。,附加体型载体（YEP）,YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2m质粒以及酵母染色体的选择标记构成。2m质粒含有自主复制起始区（Ori）和STB区,STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2m质粒，人们已经构建出许多YEP型载体。YEP型载体PYF92就是由酵母的2m质粒、pBR322质粒和酵母的His3+(组氨酸)基因构成的。YEP型载体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105转化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也高（25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。,人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。1907年Smith和Townsent等首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。,（5）Ti质粒,1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为Ti质粒。1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代，Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础。,Ti质粒为根癌农杆菌核外的一种环状双链DNA分子，长约200Kb。其中含有一段称为T-DNA的可转移区段，T-DNA的长约23Kb，在其两端各有一个25bp左右的正向重复序列，称之为T-DNA的边界序列。在不同的农杆菌Ti质粒上该序列高度保守，一般认为右端重复序列对T-DNA的转移起决定性作用。,（一）冠瘿瘤的含义冠瘿瘤是根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）感染植物后，其Ti质粒上的T-DNA片断整合进植物核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。冠瘿瘤细胞能够在没有植物激素的培养基中快速增殖并且在除掉农杆菌后继续生长。,（二）根癌农杆菌根癌农杆菌是革兰氏阴性菌，在土壤中的含量极高，它能通过伤口侵染双子叶植物，近年来已有许多实验结果表明，它也能侵染单子叶植物。根癌农杆菌含有Ti质粒，这种质粒上含有特殊的T-DNA，能随机整合到植物染色体DNA上，诱导植物发生肿瘤。,根癌农杆菌类型：（1）胭脂碱型（nopaline）（2）章鱼碱型（octopine）（3）农杆碱型（agropine）。,（三）根癌农杆菌侵染的机理（1）信号识别：受到创伤的植物细胞从伤口释放出酚类物质和单糖信号，由农杆菌chu基因编码的ChvE与Ti质粒编码的VirA,VirG蛋白组成的复合体共同接受并传递信号。（2）细胞附着：由attR位点编码蛋白合成的多糖介导初步附着，然后由细菌染色体基因的编码蛋白产生纤维素网状结构促进附着。（3）vir基因诱导：virA感应酚类信号，由此激活virG,继而诱导所有vir基因。,（4）T-链生成：virD1/virD2识别T-DNA的LB和RB，virD2在其上产生单链切口，并与错位的单链T-DNA共价连接，修复合成，最后取代错位链。（5）T-DNA胞外转移：T-链/virD2组成的T-复合体通过T纤毛输送到细菌细胞外。（6）T-复合体转移及核内定位（7）T-链整合,（四）药用植物冠瘿瘤的转化方法1叶盘转化法（1）用打孔器从消毒叶片上取得直径为25mm的叶片，亦称之为叶盘。（2）在过夜培养的对数生长期的根癌农杆菌的菌液中浸数秒钟后，置于培养基上共培养23天。（3）待菌株在叶盘周围生长至肉眼可见菌落时再转移到含有抑菌剂的培养基中除去根癌农杆菌。（4）在培养基中加入抗生素进行转化选择，经过34周培养可获得转化的植株再生。,2整体植物接种共感染法（1）人为地在整体植株上造成创伤部位（2）把农杆菌接种在创伤面上，或用针头把农杆菌注射到植株体内，使农杆菌在植株体内进行侵染实现转化，获得转化的植物细胞。,3原生质体共培养转化方法该方法是将农杆菌同刚刚再生出新细胞壁的原生质体作短暂的共培养，以便使农杆菌与细胞之间发生遗传物质的转化。原生质体共培养法也可看作一种在人工条件下诱发农杆菌对单个细胞侵染的一种体外转化法。,二、毛状根培养产生中药活性成分,（一）毛状根的含义毛状根是发根农杆菌感染植物后，其Ri质粒上的TDNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。,2020/5/30,103,（二）发根农杆菌发根农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶植物及个别的裸子植物，诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根。,（三）发根农杆菌侵染的机理发根农杆菌之所以能诱发被感染植物的受伤部位长出毛状根，是因为它具有Ri质粒。Ri质粒是发根农杆菌染色体外的一个约250kb的质粒，带有冠瘿合成酶基因。在Ri质粒上存在与转化有关的两个主要功能区，即T-DNA区(转移区)和Vir区(致病区)。Vir区基因并不发生转移，但它对T-DNA的转移非常重要。当发根农杆菌感染植物时，Ri质粒上的T-DNA可以转化并插入到植物细胞基因组中，其整合和表达的结果导致了大量毛状根的产生。,农杆菌附着在植物细胞表面,发根农杆菌Ri质粒的类型:（1）农杆碱型（2）甘露碱型（3）黄瓜碱型。,（五）毛状根的转化方法1植物体直接接种法将植物种子消毒后，在合适的培养基上进行萌发，长出无菌苗，然后取茎尖继续培养，等无菌植株生长到一定时期，将植株的茎尖、叶片切去，剩下茎杆和根部。在茎杆上划出伤口，将带Ri质粒的农杆菌接种在伤口处和茎的顶部切口处。接种后继续培养被感染的植株，经过一段时间培养，在接种部位产生毛状根。,2外植体接种法取植物的叶片、茎段、叶柄等无菌外植体，与农杆菌共同培养23天，将植物的外植体移到含有抗生素的选择培养基上进行培养，经过不断继代培养，农杆菌被杀死，转化细胞产生愈伤组织，并可诱导产生毛状根。,3原生质体共培养法将愈伤组织按常规方法制备成原生质体，原生质体再生细胞与农杆菌混合，共同培养，农杆菌对原生质体进行转化经过在含有抗生素的选择培养基上对转化细胞进行筛选，得到转化细胞克隆在分化的培养基上得到完整植株。,（六）毛状根的鉴定(1)形态鉴定：它不依赖激素快速生长，根多丛生，多分枝，多根毛，无向地性。(2)GUS活性的测定或NPTII酶的检测：从组织水平来证明Ri质粒中的TDNA是否转移整合到植物细胞的核基因组上。(3)冠瘿碱的测定：冠瘿碱合成酶基因在发根农杆菌中并不能表达，它只能在植物细胞中表达。冠瘿碱的存在可作为植物细胞转化的指标。,在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。,表达载体（expressingvector）,原核生物表达载体除克隆载体的特性外还含有：,启动子表达系统元件核糖体结合位点克隆位点转录终止信号,trp-lac启动子（ortac启动子）启动子：常用的有噬菌体Pc启动子T7噬菌体启动子,遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰,（1）大肠杆菌表达载体,细菌的基因组,Onecircularchromosome4-5Mb,（2）枯草杆菌(Bacillussubtilis),分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达载体,（3）其他,乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis),2.真核细胞表达体系,酵母细胞昆虫细胞哺乳动物细胞/组织植物细胞/组织,（1）酵母细胞,可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;商品化表达体系：酿酒酵母（Saccharomycecerevisiae）;毕氏酵母(Pichiapastoris);裂殖酵母（Schizosaccharomycepombe）,（2）昆虫细胞,可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；作为药物宿主细胞未被FDA认可,（3）植物组织,植物可大面积种植，可以廉价大规模生产；转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不方便,动物乳腺组织,分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；转基因动物制作花费巨大，实验周期长,鸟类输卵管组织,分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；实验成本低，饲养费用低；加糖方式可能与人有所不同,原核受体E-Coli受体系统外源基因复制、扩增场所链霉菌受体系统外源基因表达场所酵母菌受体系统真核受体动物（哺乳）细胞受体系统一般只作基因表植物/昆虫细胞受体系统达场所,基因工程的受体系统,1.特点：遗传背景清楚利于研究繁殖快易获得大量基因产物（20一代）含质粒利于基因转移表达非E-Coli基因，其潜力几乎是无限的,.E-Coli受体系统,2.缺点：高水平表达基因产物易沉淀、凝集、不易折叠基因产物纯化工艺复杂基因产物易受污染（内毒素）基因产物对受体菌有毒害作用基因产物易被水解从安全角度并不理想缺乏基因产物表达后加工机制,特点：安全性大遗传信息和生理状况更适合于真核基因表达基因产物外分泌遗传背景较清楚具基因表达后加工机制,二.酵母菌受体系统,三、基因克隆技术,基因工程的基本操作程序包括：目的基因的获取；目的基因与载体DNA体外重组；重组DNA分子导入受体细胞；筛选并鉴定无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）；外源基因的表达。,目的基因有时应用重组DNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或DNA序列，有时是为获得感兴趣基因的表达产物-蛋白质。,以质粒为载体的DNA克隆过程,1直接从染色体DNA中分离：仅适用于原核生物基因的分离，较少采用2人工合成根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。3.从mRNA合成cDNA采用一定的方法钓取特定基因的mRNA，再通过逆转录酶催化合成其互补DNA（cDNA）4从基因文库中筛选5利用PCR合成,（一）目的基因的获取,化学合成法,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,组织或细胞染色体DNA,基因片段,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,基因组DNA文库,2020/5/30,132,2020/5/30,133,（二）载体和目的基因的重组,即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的DNA分子。1.粘性末端连接法：当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。,载体DNA与目的基因的连接,DNA的一段序列,EcoRI识别序列,2020/5/30,136,ECORI切割位点,2020/5/30,137,2020/5/30,138,目的基因,2020/5/30,139,2020/5/30,140,2.人工接尾法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。,3.人工接头连接法：将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。,1.受体细胞受体细胞是能摄取外源基因，并使其稳定维持的细胞。原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、棒状杆菌和蓝细菌。真核细胞：真菌细胞、植物细胞、动物细胞。,（三）重组DNA导入受体细胞,条件：具有较高安全性，不会造成生物污染重组DNA分子容易导入克隆子容易筛选重组DNA分子在受体细胞内能稳定维持外源基因在其中能高效表达遗传性稳定易于扩大培养或发酵,重组DNA导入受体细胞的途径重组DNA需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。在基因工程研究领域的人们倾向于把所有将外源基因导入受体的过程称为转化。,载体法将目的基因连接到特定的载体(转化载体)上，利用载体进入细胞并整合到受体染色体上的能力实现外源基因转化。重组质粒可通过转化方式导入宿主细胞。如果是用噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌体，再通过转染方式将重组噬菌体DNA导入大肠杆菌等宿主细胞。,理化方法导入外源基因,理化方法是采用物理、化学方法使受体细胞膜产生局部破损或缺陷，被动吸纳外源DNA片段。(1)微注射/显微注射。显微镜下用注射器将DNA片段注入受体细胞(动物受精卵)。：0.5-10m尖头玻璃管。(2)基因枪。将DNA片段(载体)包在钨或金微粒表面(1-3m)，用静电或火药爆炸等驱动微粒射入受体。(3)电穿孔法。将受体细胞置于脉冲电场中，可以使细胞膜产生短暂的(30nm)左右的微孔，吸收DNA片段。(4)化学法。如PEG(聚乙二醇)可以刺激原生质体产生吸收DNA片段。常用PEG与电穿孔法结合，提高外源DNA的吸收率。,1.磷酸钙共沉淀法（Calciumphosphateco-pecipitation）,外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙混合，形成微小颗粒，沉积在细胞表面，被宿主细胞摄取。,2.电穿孔法（electroporation）,外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中，在高频电流作用下，细胞膜出现许多小孔，外源DNA进入宿主细胞。,3、DEAE葡聚糖（DEAEDextran）法,（带正点荷）,经细胞内吞作用吸入细胞短暂表达,外源DNA（带负电荷）,4、脂质体(liposome)介导基因导入,阳离子脂质体（膜成分）DNA负电荷,与细胞膜溶合外源DNA被释放到胞浆短暂表达,5、显微注射法（microinjection）,将外源基因通过毛细玻璃管，再显微镜下注释到受精卵的细胞核内的方法。,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收DNA分子,（四）克隆子的筛选,1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,(插入失活法)抗药性标记选择,组氨酸缺陷型大肠杆菌,无组氨酸的培养基,酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,2020/5/30,155,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,RNA分子杂交,抗原-抗体杂交,（五）基因的表达,1、基因在原核细胞中的表达大肠杆菌是当前采用最多的原核表达体系，尚有一些不足之处：缺乏转录后加工机制，只能表达克隆cDNA，不宜表达真核基因组DNA；缺乏适当的翻译后加工机制，表达真核蛋白质不能形成适当折叠或进行糖基化修饰；很难表达大量的可溶性蛋白等。,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小结,重组DNA技术操作的主要步骤,2020/5/30,159,（六）基因工程菌发酵,基因工程菌的培养过程主要包括：（1）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分拆表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；（2）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。一、基因过程菌的培养方式常用的有：补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养。1、补料分批培养将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方式。,2、连续培养将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至一定浓度后，开动进料和出料的蠕动泵，以控制一定稀释率进行不间断的培养。3、透析培养利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其生产菌的不利影响。4、固定化培养二、基因工程菌的发酵工艺基因工程菌的发酵工艺与传统的微生物发酵工艺的区别：（1）生物材料方面（2）生产目的方面1、培养基的影响常用碳源有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。,常用的氮源有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解产物、玉米浆和氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等。另外还要加一些无机盐、微量元素、维生素、生物素等。对营养缺陷型菌株还要补加相应的营养物质。2、接种量的影响接种量是指移入的种子液体和培养液体积的比例。接种量小，不利于外源基因的表达，大接种量有利于对基质的利用，缩短生长延迟期，并使生产菌能迅速占领整个培养环境，减少污染机会，但接种量过高又会抑制后期菌体的生长。所以接种量大小取决于生产菌种在发酵中的生长繁殖速度。3、温度的影响温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子调节分子的合成水平上。,在复制水平上，可通过调控复制，改变基因拷贝数，影响基因表达；在转录水平上，可通过影响RNA聚合酶的作用或修饰RNA聚合酶，来调控基因表达；温度也可在mRNA讲解和翻译水平上影响基因表达，温度还可能通过细胞内小分子调节分子的量而影响基因表达，也可通过影响细胞内ppGpp量调控一系列基因表。温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。4、溶解氧的影响溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。,5、诱导时机的影响一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达。6、pH的影响pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响，所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的调节。总之，工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化工艺。三、基因工程菌的培养设备发酵罐的组成部分有：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统以及培养液配置及连续操作装置等。（见图36）,（七）基因工程药物的分离纯化,许多医药生物技术产品都是活性肽或蛋白质。这些产品的制得具有下列特点：（1）目的产物在初始物料中含量较低（2）含目的产物得初始物料组成复杂，且影响较大（3）目的产物得稳定性差（4）种类繁多（5）应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热原等。因此，为了获得合格得目的产物，必须建立与上述特点相适应的医药生物技术产品的分离纯化工艺。,一、建立分离纯化工艺的依据1、含目的产物的起始物料的特点：包括（1）菌种类型及其代谢特性（2）原材料和培养基的来源及其质量（3）生产工艺和条件（4）初始物料的物理、化学和生物学特性。2、物料中杂质的种类和性质3、目的产物特性4、产品质量的要求二、分离纯化的基本过程分离纯化是基因工程药物生产中极其重要的一环。一般不应超过45个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。,三、分离纯化的技术分离纯化技术应满足下列要求：（1）技术条件要温和（2）选择性要好（3）收率要高（4）两个技术之间要能直接衔接（5）整个分离纯化过程要快1、细胞破碎与固液分离：有细胞收集、细胞破碎和细胞碎片分离等步骤。（1）细胞收集：细胞收集常用的是离心分离的方法，膜过滤法液逐步得到广泛应用。（2）细胞破碎：有机械破碎法和非机械破碎法。机械破碎法：高压匀浆法、超声破碎法、高速珠磨法、高压挤压法非机械破碎法：酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。,基因工程药物制造实例,基因工程药物（Geneticengineeringdrugs）：系指先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白合成过程的基因分离、纯化或进行人工合成，利用重组DNA技术加以改造，最后将该基因放入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的新型药物称为基因工程药物。,基因工程技术可生产的药物和制剂包括：（1）免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体；（2）细胞因子，如各种干扰素(interferons）、白细胞介素(interleukina)、集落刺激生长因子（colony-stimulatingfactors，CSF)、表皮生长因子、凝血因子；促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）（3）激素，如胰岛素（insulin)、生长激素（growthhormone、心素纳；人生长激素释放抑制因子humansomatotin)（4）酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、超氧化物歧化酶。,基因工程技术生产药物的优点,（1）利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白质和多肽，为临床使用提供有效保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的引用范围；（3）利用基因工程技术可以发现，挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源生理活性物质在作为药物使用存放的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源.,胰岛素分子结构,胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！大规模工业化生产不但解决了这种比黄金还贵的药品产量问题，还使其价格降低了30%-50%!,胰岛素生产车间,干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。,干扰素生产车间,干扰素分子结构,基因工程人干扰素-2b（安达芬）是我国第一个全国产化基因工程人干扰素-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。,人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。,人造血液及其生产,1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品人胰岛素投放市场它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。迄今累计已有近30种基因工程药物投入市场，产生了巨大的社会效益和经济效益:人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等,我国基因工程药物研究和开发,起步较晚，基础较差。1b型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有国际先进水平的生物高科技成果，于1997年通过期临床，并获得国家一类新药证书，成为“863”计划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市，在研究开发中的也有10余种。,下一步上一步结束放映,已投入使用（含临床试验）的基因工程疫苗,正在开发的350种生物技术药物中，1/3以上用于肿瘤，其中有30种用于黑素瘤，20种用于结直肠癌，13种用于乳腺癌，13种用于前列腺癌。正在开发的疫苗有77种，用于预防或治疗HIV感染、A