生物工程下游技术第五章-细胞破碎、蛋白质复性和固液分离

第二章目标产物的分离和纯化，第五章细胞裂解，蛋白质复性和固液分离，细胞裂解，固液分离，初级分离(粗)，纯化和精制，下游技术的基本过程，下游加工技术的重要性1。产品分离纯化是最终获得商品的环节。2.投资成本高(60%的抗生素、乙醇和柠檬酸)。3.落后的分离纯化技术将阻碍发酵工程技术的发展。发酵液中几种产品的浓度典型产品浓度(克/升)抗生素25氨基酸100酒精100有机酸100酶20蛋白质10，下游加工技术的特点1。发酵液的复杂性使得分离困难。2.待提取的产品通常浓度低且不稳定。3.大多数操作都是分批操作，每一批发酵液都是不同的，这就要求下游处理有一定的灵活性。产品纯化过程的差异取决于目标材料、目标产品的特性及其纯度要求。第一节总结了基因工程生物产品的分离纯化是：工程菌大规模培养后，产生的有效成分含量很低，但杂质含量很高。分离和纯化极其重要。转化细胞和产品对基因工程药物的纯度要求高于传统产品。基因工程产品分离和纯化的一般过程，初级分离：细胞和培养基的分离，细胞释放产物的破坏，内含物(包涵体)的溶解，蛋白质的恢复，产物的浓缩，大部分杂质的去除等。主要决定产品的收率。纯化和精制：在初级分离的基础上，通过各种高选择性手段，主要是各种色谱技术，尽可能多地分离目标产物和干扰杂质，使产品纯度符合相关要求。主要测定产品的纯度。产品的纯化过程包括两个基本阶段：细胞分裂的第二阶段，其目的是释放细胞内容物。分类：根据有无外力，分为机械法和非机械法。问题：破碎率越高越好吗？以大肠杆菌为宿主的药物大多是细胞内产物。细胞破碎方法分类图。1.高压均化法。成分：高压泵和均质阀的作用机理：高压泵将电机的旋转运动转化为均质阀杆的直线运动，将细胞悬液从高压腔(数十兆帕)中压出，在冲击环的冲击下改变方向，从出口管中排出，使细胞在较高流速的剪切碰撞下发生较大变形，从而达到破碎细胞的目的。高压均质阀、进液口、出液口、阀座、碰撞环、阀杆、高压均质器结构示意图，19.6-25.4兆帕，适用于破碎酵母和大部分细菌细胞，高压均质法动力学方程，破碎效率与均质阀结构、工作压力和破碎次数有关：Ln(Rm/(Rm-R)=KNPaR:单位生物质释放的最大产品量(mg/g)Rm:R；k:破碎率常数；n:压碎次数；操作压力；A:与微生物特性相关的指数系数。破碎率-操作压力-温度控制-能量消耗-温度使活性物质失活增加能量消耗增加压力：3.5KW/100兆帕，除去热量的成本：23.8/100兆帕，高压均质通常需要多级操作，级间冷却通常在每个循环之前进行，均质过程中产生的热量蛋白质和酶的失活，温度控制和能量消耗，堵塞(不适合块状或丝状真菌)，硬组织如包涵体等容易损坏均质阀，也不适合高温，容易失活和高能量消耗。2、高速珠磨法，原理：细胞和极细磨料在搅拌桨的作用下充分混合，珠通过夹套冷却实现温度控制，效果良好。能量消耗与细胞破碎率成正比。问：高压匀浆比珠磨粉碎细胞更好吗？温度控制和能量消耗、高压均质法和高速珠磨法的比较、X-Press挤出机，浓缩的细胞悬浮液被冷却到-25至-30以形成冰晶，并且使用高于500兆帕的高压冲击从高压阀孔挤出冷冻细胞，并且细胞破裂是由冰晶的磨损和嵌入冰中的细胞变形引起的。其优点是细胞碎片破碎程度低，生物活性好。3、超声波破碎机理：当输入高强度声能时，声频高于15 20khz的超声波可以破碎细胞。破碎机理尚不清楚，可能与空化产生的冲击波和剪切力有关。破碎效率与音频、声能、处理时间、细胞浓度和应变类型等因素有关。本发明操作简便，液体损失少，敏感物质变性失活少，噪音大，大容量效率低，应用潜力有限。空化：由强声波引起的气泡的形成、膨胀和破裂。锡箔纸测试空化强度和空化密度，可见空化现象，超声波破碎机，高功率超声波破碎机，4，化学渗透方法，作用机理：一些有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂和其他化学物质可以改变细胞壁或膜的渗透性，从而允许内容物有选择地渗透出来。这种处理方法称为渗透法。问题：乙二胺四乙酸、甲苯、TritonX-100、盐酸胍和尿素的作用机理？P70，乙二胺四乙酸：甲苯，它破坏细胞的外膜；TritonX-100，它溶解细胞膜的磷脂层；盐酸胍和尿素，溶解内膜的双磷脂层：削弱溶质分子之间的疏水作用，使疏水化合物溶解在水溶液中。优点(相对机械粉碎):对产品释放有一定的选择性；细胞保持完整，只有少量碎片，这有利于进一步提取。释放的核酸量少，粘度低，进一步分离方便。缺点：时间长，效率低；化学试剂有毒；普遍性差，5。酶促溶解方法、机理：细胞壁和细胞膜被生物酶消化溶解。常用溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、内肽酶、几丁质酶、细胞壁裂解酶(几种酶的复合物)等。优点：一定的选择性；细胞形态完整，核酸释放少，有利于进一步分离。缺点包括：(只能在实验室使用)产品抑制导致的低效率；溶菌酶价格高；通用性差，难以确定最佳条件；6、微波加热方法、机理：微波加热使细胞中的极性物质，尤其是水分子，吸收微波能量并产生大量热量，导致细胞内温度迅速上升。液态水蒸发产生的压力会使细胞膜和细胞壁破裂，形成小孔。进一步加热会导致细胞内部和细胞壁的含水量降低、细胞收缩和表面裂纹。优点：微波穿透性强，选择性高，加热效率高。缺点：一般来说，它只适用于热稳定物质的分离。处理后的材料应具有良好的吸水性。不适合富含淀粉和树胶的天然植物，比较机械粉碎法和非机械粉碎法，克隆和表达的产品，基因工程细胞，蛋白质、没有活性，一级结构正确，立体构型错误，没有生物活性！包涵体，第3节蛋白质复性，不溶于水，只能溶解在变性溶液中。在病毒增殖过程中，有个包涵体。大肠杆菌包涵体，半乳白色包涵体，具有类似蛋白质的病理结构，通常在宿主细胞中形成。包裹体形成的原因如下：(复杂，目前还不完全清楚。(缺乏某些辅助因素(分子伴侣？)还是由于迪斯科应该考虑的是：尽量减少夹杂物的形成！减少包涵体形成的策略1。降低重组细菌的生长温度和降低培养温度是减少包涵体形成最常用的方法。较低的生长温度降低了非活性聚集体和疏水相互作用的形成速率，从而减少了包涵体的形成。在大肠杆菌培养过程中添加高浓度的多元醇、蔗糖或非代谢糖可以防止分泌型蛋白质聚集反应。在最佳浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞生长、蛋白质合成或运输。促进重组蛋白可溶性表达的其他生长添加剂包括乙醇(诱导热休克蛋白的表达)、低分子量巯基或二硫化物化合物(影响细胞周质的还原状态，从而影响二硫键的形成)和氯化钠。3.提供丰富的培养基，创造最佳的培养条件，如供氧、酸碱度等。添加能促进重组蛋白可溶性表达的生长添加剂。蛋白质复性：包涵体蛋白质以变性状态溶解在变性溶液中，所有氢键和疏水键被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键没有被破坏。当去除变性剂时，部分蛋白质可以自动折叠成正确的活性构型。这种折叠过程被称为蛋白质复性。如何将包含体配置恢复到正确的状态？包涵体的分离和溶解，包涵体的分离：破碎培养物中收集的细胞(高压匀浆结合溶菌酶处理)，然后离心(5000-20000 g/r)以沉淀大多数包涵体并将其与可溶性蛋白质分离。洗涤：除去包涵体中沉淀的脂质和膜蛋白，一般加入去污剂(TritonX-100或脱氧胆酸钠)和低浓度变性剂(2mol尿素或盐酸胍等)。)。为了避免重组蛋白在包涵体溶解和复性过程中降解。溶解：包涵体的溶解必须使用强变性剂来溶解蛋白质，通过离子的相互作用来破坏包涵体蛋白质之间的氢键。盐酸异氰胍的增溶作用最强，尿素的增溶作用稍差。洗涤剂(如十二烷基硫酸钠)可以破坏蛋白质中的疏水键，溶解几乎所有的蛋白质，但不允许用于制药工业，因为它们不能被完全去除。酸(如70%甲酸)可以破坏蛋白质的二级键来溶解蛋白质。这种方法只适用于少数蛋白质。对于含半胱氨酸的蛋白质，应在溶解过程中加入还原剂(如双硫转移酶、谷胱甘肽、-甲基异戊二烯)，以打开蛋白质中的所有二硫键。对于没有二硫键的靶蛋白，有时也应使用还原剂，因为含有二硫键的杂质蛋白会影响包涵体的溶解。同时，还应加入金属螯合剂，如乙二胺四乙酸或EGTA，以螯合金属离子，如Cu2和Fe3，防止与还原态的巯基发生氧化反应。蛋白质折叠的机理，有许多不同的假设，但许多学者认为，在状态的中间有一个“熔化的球状态”，在“熔化的球状态”中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构正在开始成形，并且可以进行一些局部调整以形成正确的三维结构。蛋白质的具体步骤可以用下面的公式来描述：拉伸状态中间状态后期中间状态自然状态聚集。核糖核酸酶变性和复性示意图(一)天然核糖核酸酶(二)变性和失活(三)“无序”核糖核酸酶。错误发生的机制在复性过程中，部分折叠中间体的疏水簇被暴露出来，分子间的疏水相互作用将导致蛋白质聚集。(2)伸展肽链折叠成天然活性结构的过程受到周围环境的影响，如温度、酸碱度、离子强度、复性时间等因素。不同条件下的具体复性方法，1。透析、稀释和超滤复性方法：最传统、最广泛使用的原理将变性剂的浓度降低到蛋白质的浓度高蛋白质浓度下的复性方法成功的复性过程是在高蛋白质浓度下获得高复性率。(1)缓慢、连续或间断地将变性蛋白加入复性缓冲液中，使蛋白在添加过程中或添加阶段之间有足够的时间进行折叠复性。因为完全折叠的蛋白质通常不会与被折叠的蛋白质聚集在一起。(2)温度跳跃策略：变性蛋白质在低温下被再折叠和折叠以减少聚集，直到大多数容易聚集的中间体被转化为不容易聚集的后期中间体，然后温度迅速升高以促进后期中间体快速折叠为蛋白质的天然构象。(3)复性在中等变性剂浓度下进行，该浓度应足够高以有效防止聚集，并足够低以启动正确的复性。(3)带启动子的复性方法：包涵体蛋白折叠复性启动子的促进作用可分为稳定正确折叠蛋白的天然结构、改变错折叠蛋白的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解度和增加未折叠蛋白的溶解度。常见的加速剂：a，共溶剂：例如，通过与中间体形成非聚集的复合物，防止了蛋白质分子之间的相互碰撞机会，减少了蛋白质的聚集；洗涤剂和表面活性剂：如TritionX-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等。可以促进蛋白质的复性，但它们会与蛋白质结合，难以去除。c、氧化还原剂：对于含有二硫键的蛋白质，应在复性过程中加入氧化还原系统，通过促进不正确形成的二硫键的快速交换反应，提高正确配对的二硫键的产率；小分子添加剂，如盐酸胍或尿素、烷基尿素、碳酸酰胺等。可以防止蛋白质聚集。e、0.4 0.6 ml-arg: l-arg能使折叠错误的蛋白质结构和连接错误的二硫键不稳定，使折叠向正确的方向进行，并能大大提高包涵体蛋白质的折叠效率。9，f，添加分子伴侣和折叠酶G，人工伴侣H，单克隆抗体I，其他：多离子化合物，甘油等。此外，还有：(4)液相色谱复性：疏水作用色谱，离子交换色谱，凝胶排阻色谱和亲和色谱成功复性变性蛋白质。氢氧化铝的分离效果理想。证券交易委员会是最糟糕的；盐酸胍将保留在离子交换树脂柱上，并用蛋白质洗脱。自动售检票系统具有适用范围窄、所需时间长、价格高等优点。变性蛋白在HIC上的复性机理：当蛋白、变性剂和杂蛋白进入HIC系统时，变性剂对柱的作用力相对较弱，变性蛋白的作用力相对较强。变性剂首先从变性蛋白中分离出来，然后用流动相流出色谱柱。随着流动相的不断变化，变性蛋白质不断吸附-解吸-再吸附在固定相表面，并在此过程中逐渐复性，形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质，流出色谱柱。液相色谱复性的优点：(与传统的稀释法和透析法相比)注射后变性剂可以快速去除；色谱固定可以明显减少甚至完全消除变性蛋白分子从变性剂环境中分离后的分子聚集，从而避免沉淀的产生，提高蛋白的复性质量和活性回收率。在蛋白质复性同时，可以将目的蛋白和外源蛋白分离，达到纯化的目的，复性和纯化可以同时进行；便于回收变性剂，降低废水处理成本。反胶团复性：表面活性剂的极性头向内，疏水尾向外，中间形成一个极性“核”。有机溶剂，极性“头”，极性“芯”，非极性“尾”。蛋白质可以在反胶束的水相中保持它们的构象和活性，这可以将蛋白质彼此分离并减少蛋白质折叠过程中的聚集。第4节so(1)离心沉降：根据固液密度差，通过离心机提供的离心力实现固液分离。优点：易于掌握技术；结果固体和液体的密度差、固体和液体的其他性质以及离心机的离心能力决定了沉降的困难性和良好的重复性。(它可以用粒子沉降速度来表示)。斯托克斯公式(斯托克斯): UC