基因工程实验三、质粒的制备及目的基因的扩增

岳续朋生物工程教研室,实验三质粒的制备及目的基因的扩增,实验目的：,1、了解质粒DNA提取的方法；2、掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理及方法；3、熟悉常用试剂的配制方法。,第一部分：质粒的提取,实验原理：,质粒(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子。大多数质粒都是双链的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA)分子，天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。,细菌裂解,细胞的裂解方法很多，如去污剂法、沸水热裂法、碱变性法、有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择,原理细菌悬浮液暴露于高pH的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效沉淀下来，离心去除后，就可从上清液中回收质粒DNA。,碱裂解法(Alkaline),碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分:,SolutionI:50mMl葡萄糖/10mMlEDTA/25mMlTris-HCl，pH=8.0；Tris-HCl的作用是提供合适的pH值，EDTA的作用是抑制DNA酶的活性，葡萄糖的作用是悬浮；SolutionII:0.2MlNaOH/1%SDS；作用是使细胞裂解；（都要新鲜配制）SolutionIII:3Ml醋酸钾/2Ml醋酸；作用：SDS与醋酸钾形成十二烷基硫酸钾（PDS,沉淀），而蛋白容易和SDS结合，所以蛋白被沉淀下来，而长长的基因组DNA也被沉淀下来。,质粒抽提试剂盒的使用,质粒抽提试剂盒的使用,注意事项：,1、如果是手提质粒，溶液2一定要现配现用；2、加溶液1时，一定要将菌块完全悬浮，不能有团块，否则会影响细菌的裂解；3、加溶液2和3时，不能剧烈震荡，以免使基因组DNA断裂，不能完全被沉淀下来；,第二部分：目的基因的扩增,目的：1、了解引物设计的原理；2、掌握PCR技术的原理及操作。,是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，引物是PCR特异性反应的关键PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增,3,3,5,5,Senseprimer,Antisenseprimer,引物设计的原则,引物长度：15-30bp，常用为20mer左右引物的有效长度不能大于38mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74），不能保证PCR扩增产物的特异性，太短也会降低特异性。引物扩增跨度：以500bp为宜特定条件下可扩增长至10kb的片段。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列避免引物内部出现二级结构避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带,引物3端的碱基要求严格配对特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。5端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。避免引物形成发夹结构尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。,引物设计的原则,PCR原理,聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。,PCR原理,模板DNA,PCR原理,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR反应的五要素：,PCR反应的五要素：1、引物（primer）2、酶（TaqDNApolymerase）3、dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）4、模板（template）5、Mg2+（magnesium）,PCR原理,PCR反应的条件：,94，5min