第十章 固定化酶2010.ppt

第十章固定化酶,（ImmobilizedEnzyme）,酶的优点：酶在工业中使用的缺点：酶在水溶液中易失活不能反复使用，而且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制成本高。理想的可用于工业的生物催化剂：既具有酶的催化特性，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，并且生产工艺可以连续化、自动化,固定化酶：指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。,1916年，Nelson和Griffin将转化酶吸附在木炭上，活性与原酶一样1948年，Summer制备出不溶于水的刀豆脲酶，具有原酶活性1953年，Grubhofev和Schleith首先开始了酶固定化研究，并第一次实现了酶的固定化。1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-氨基酸的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这是世界上固定化酶用于工业的开端。1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌细胞，成功实现了L-天冬氨酸连续生产。,固定化酶的优点：酶的稳定性得到改进；酶可以反复利用；可以管道化，连续化及自动化；酶与产物易于分开，产物容易提纯；反应所需的空间小；,固定化酶的缺点：固定化时，酶活力有损失；增加了生产的成本，工厂初始投资大；只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；与完整菌体相比不适于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；胞内酶必须经过酶的分离手续。,第二节酶的固定化方法,一、载体结合法载体结合法是将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。1物理吸附法：这是酶通过氢键、疏水键等作用力物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。载体：无机载体有活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；天然高分子载体有淀粉、谷蛋白、大孔型合成树脂、陶瓷等,物理吸附法优点：操作简单酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少酶失活后载体仍可再生物理吸附法缺点：酶与载体相互作用力弱对离子强度、pH、温度等因子敏感，酶易脱落导致酶活下降并污染产物最适吸附酶量无规律可循,2离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。载体：多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂。例如DEAE一纤维素（或葡聚糖凝胶），CM-纤维素，AmberliteCG-50，Dowex-50等。,世界第一例获得工业应用的固定化酶是DEAE-SephadexA-25吸附的氨基酰化酶反应用于DL-AA的光学分析。,离子结合法优点：操作简单处理条件温和酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏酶活回收率较高离子结合法缺点：载体和酶的结合力比较弱容易受缓冲液种类或pH的影响在离子强度高的条件进行反应时，酶易从载体上脱落,3共价结合（偶联）法：酶以共价键结合于载体的固定化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。,操作时的两类方法：将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。可与载体结合的酶的功能团有或-氨基、-羧基、疏基、羟基、咪唑基、酚基等，但参与共价结合的氨基酸残基应当不是酶催化活性所必需的,共价结合法优点：载体与酶偶联的方法多样化；酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。共价结合法缺点：反应条件苛刻，操作复杂偶联试剂对生命组织多有一定毒性由于采用了比较激烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心（酶活回收率30左右）底物的专一性等酶的性质可能会发生变化,二、交联法交联法是双功能或多功能试剂使酶分子之间交联的固定化方法。此法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶，所不同的是它不使用载体。,酶蛋白分子彼此交叉连接起来，形成网络结构,交联剂：形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯胺或N,N-乙烯双马来亚胺等。参与交联反应的酶蛋白的功能基团：N-末端的-氨基、赖氨酸的-氨基、酪氨酸的酚基、半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基等。交联法的优缺点：优点是操作简便。缺点：反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般比较低，常出现扩散限制，使用有一定难度。尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间有利于固定化酶比活的提高。,酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。酶辅助蛋白交联：当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体”蛋白来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。这种“载体”蛋白可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。,三、包埋法,1、凝胶包埋法（胶格包埋法）（网格型）将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法：先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶可与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。海藻酸钠、胶原和明胶也是常用的包埋载体。,2、微囊化包埋法（微囊型）微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体中。微囊型固定化酶通常是直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。胶囊和脂质体主要用于医学治疗。作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。,微囊制备方法,（1）界面沉淀法：是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。例如：先将含血红蛋白的酶溶液在水不互溶的有机相中乳化，这时它们就会在油溶性的表面活性剂存在的情况下形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物在油水界面上沉淀、析出，形成膜，将酶包埋，最后在乳化剂的帮助下由有机相移入水相。优点：条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。,（2）界面聚合法：是利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。它所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。例如，将含血红蛋白的酶溶液与1，6己二胺的水溶液混合，再与含癸二酰氯的氯仿加以混合并乳化，己二胺和癸二酰氯就会在油水界面上发生聚合反应，形成尼龙膜，将酶包埋。除尼龙膜外还有聚酰胺、聚脲等形成的微囊。此法制备的微囊大小能随乳化剂浓度和乳化时的搅拌速度而自由控制，制备过程所需时间非常短。但在包埋过程中由于发生化学反应会引起酶失活。,（3）表面活性剂乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法微囊型包埋法具有较大的医学价值。微囊半透膜可以阻止蛋白质分子渗透和进入，注入体内可避免引起免疫过敏反应，同时也可免遭蛋白酶的降解。但成本较高，反应条件要求高。,包埋法优点：一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高可进行大量的固定化；包埋膜可选用生物相容材料，并可做成任意大小包埋法缺点：在发生化学聚合反应时包埋，酶容易失活包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶，不适用于柱系统,图10-1固定化酶的模式（a）离子结合；（b）共价结合；（c）交联；（d）聚合物包埋；（e）疏水相互作用；（f）脂质体包埋；（g）微胶囊；,固定化方法与载体的选择,1.必须注意维持酶的催化活性和专一性2.酶与载体结合牢固3.载体的机械强度4.固定化酶要有最小的空间位阻5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应6.固定化酶要廉价,表酶的各种固定固定化方法比较,第三节固定化酶的形状与性质,一、固定化酶的形状（1）颗粒状（2）纤维状（3）膜状固定化酶（4）管状固定化酶一般言之，颗粒状或片状固定化酶对连续流搅拌桶式反应器和填充式反应器类型的反应器均可适用。但膜状和纤维状的固定化酶则不适于连续流搅拌桶式反应器，而适用于填充式反应器。,二、固定化酶的性质,分配效应空间障碍效应扩散限制效应,（一）影响固定化酶（细胞）性质的因素,酶经过固定化后引起的性质改变的原因：一是酶本身的变化，二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。载体物化性质和固定化过程影响主要存在三种影响效应：,1、分配效应微环境是在固定化酶附近的局部环境。宏观环境指主体溶液。由底物、产物和各种效应物在两个环境之间的不同分配，被称为分配效应。,2、空间障碍效应固定化之后，由于酶的空间自由度受到限制(因为载体的空隙太小，或者固定化方式与位置不当，给酶的活性部位造成了空间屏障)，使酶分子的活性基团不易于底物或效应物接触，影响酶分子的分子活性中心对底物的定位作用,所造成的对固定化酶的活力的影响效应，被称为空间障碍效应。,3、扩散限制效应酶固定化使生物催化反应从均相转化为多相，于是产生了扩散阻力：1）外扩散阻力是底物从宏观环境向酶颗粒表面传递过程中的一种扩散限制效应，它发生在反应之前，发生在固定化颗粒周围的液膜层。它会使底物在固相酶周围形成浓度梯度，通过增加搅拌速度和底物流速的方法可以减少外扩散效应。2）内扩散阻力是指底物分子达到固相酶表面后传递到酶活性部位时的一种扩散阻力，它与催化反应同时进行。载体小而弯曲的细孔是产生内扩散阻力的要原因。因此使用低分子量底物，小的粒径、载体孔尽可能大而直且互相连通，或仅仅将酶固定在载体表面都可以降低这种内扩散阻力。,（二）固定化酶性质的改变1.活力变化固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专一性也会受到影响发生改变。活力下降的原因：酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。固定化后的空间障碍效应的影响。内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近受阻。,2.固定化后酶稳定性变化酶稳定性包括其对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。酶固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。稳定性提高的原因：固定化后的酶与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。酶活力的缓慢释放。反应开始只有部分酶起作用，其余部分仅在开始起作用的酶变性后才起作用。抑制自降解，提高了酶稳定性。,操作稳定性：常用半衰期表示，即酶的活力降为初活力一半时所经历的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上时，即具有工业应用价值。贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否则活力逐渐下降。热稳定性：氨基酰化酶：天然酶70oC15min，活力几乎全部丧失，固定于DEAE-纤维素的固定化酶，可以保存60%活力，固定于DEAE-葡聚糖，可以保存80%活力。,对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后对蛋白酶的耐受力有所提高。可能的原因是由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。例如：氨基酰化酶，天然酶在胰蛋白酶做用下，活力保存23%，固定于DEAE-纤维素的固定化酶，可以保存33%活力，固定于DEAE-葡聚糖，可以保存87%活力。对变性剂、抑制剂的抵抗能力,3.固定化酶的作用pH变化酶固定化后，对底物的最适pH曲线常常发生偏移。一般来说，带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值较游离酶偏高，反之，若使用带正电荷载体的话，其最适pH值较游离酶偏低，即向酸性偏移。曲线偏离的原因是微环境表面电荷性质对酶活力的影响。因为带负电荷的载体吸附阳离子，使固定化酶扩散层H+浓度高，外部溶液的pH必须向碱性偏移才能抵消微环境的作用，使酶表现最大活力。,4.固定化酶的最适温度的变化酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。因为固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高。,5.米氏常数Km的变化固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。有的增加很小，有的增加很大，也可能会变小。如果载体和底物电荷相反，则表观Km会减小。,（三）固定化酶（细胞）的活力固定化酶的活力即是固定化酶催化某一特定化学反应的能力。其大小可以用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。它的单位可定义为每毫克干重固定化酶每分钟转化底物的量：用mol/minmg或molmin-1/cm2测活时要注明条件：温度，搅拌速度，固定化原酶含量等1）、活力测定方法分为：间歇测定：在搅拌或振荡反应器中，在与溶液酶同样测定条件下进行，然后间隔一定时间取样，过滤后按常规进行测定。连续测定：固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液，根据流速和反应速度之间关系，算出酶活力。,活力回收=100%3）、固定化酶（细胞）的半衰期在连续测定条件下，固定化酶的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间称为固定化酶的半衰期。以t1/2表示。固定化酶的操作稳定性是影响使用的关键因素，半衰期是衡量稳定性的指标。,2）、固定化酶的活力回收,固定化酶（细胞）热稳定性变化,固定化酶（细胞）对有机试剂（乙醇）稳定性变化,固定化酶（细胞）对酶抑制剂（尿素）的稳定性变化,固定化酶（细胞）对pH稳定性变化,固定化酶的应用,固定化酶在工农业生产上的应用固定化酶在医药治疗上的应用固定化酶在分析化学中的应用固定化酶与基础理论,固定化酶在工农业生产上的应用,固定化生长菌体在三废处理上的应用,固定化酶在医药治疗上的应用溶液酶的应用缺陷：酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白质酶水解破坏由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度,1.转入体内发挥作用（口服和注入）口服：最初主要限于消化酶类，近年来也有人尝试将酶以口服方式用于尿中毒等疾患的治疗。口服的优点是药物通过粘膜吸收后能迅速进行扩散，进入体内，通常不会引起免疫反应。注入：是最有实用价值的一种方式，溶液酶的弱点集中于此方式。固定化酶可很好的地解决这一问题，办法是将药物酶包埋于半透膜中，可容许小分子底物自由出入包埋膜，而药物酶和破坏它的蛋白水解酶以及其他免疫因子等不会直接接触，因而可延