微生物工程概论课件

1,微生物工程,河北联合大学生命科学学院主讲：丁存宝E-mail:dingcunbaoTel2,微生物工程课程提纲（32学时）,绪论第一章生产菌种的筛选第二章微生物代谢调节和代谢控制第三章优良菌种选育第四章菌种保藏的原理和方法第五章培养基第六章发酵工艺控制第七章微生物反应动力学第八章灭菌第九章微生物工程生产举例(啤酒生产工艺学),3,绪论,一、微生物工程的地位和意义二、微生物工程的定义和特点三、微生物工程的组成四、微生物工程的发展简史五、微生物工业六、微生物工程的现状和发展趋势七、微生物工程的课程任务,4,一、微生物工程的地位和意义,生物工程的学科定义和研究内容生物工程(bioengineering)：是以生物学(特别是其中的微生物学、遗传学、生物化学和细胞学)的理论和技术为基础，结合化工、机械、电子计算机等现代工程技术，充分运用分子生物学的最新成就，定向地改造生物或其功能，再通过合适的生物反应器对这类“工程菌”或“工程细胞株”进行大规模的培养，以生产大量有用代谢产物或发挥它们独特生理功能一门新兴技术。生物工程研究内容：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、发酵工程。,5,基因工程（geneticengineering）：利用基因体外重组技术，构建出新型的微生物菌株，培育出新的动植物品种或使其具有优良性状。蛋白质工程（proteinengineering）：通过对蛋白质分子结构的合理设计，利用基因工程的手段生产出具有更高生物活性或独特性质的蛋白质。细胞工程（cellengineering）：利用细胞融合技术把含有不同遗传物质的细胞合成杂种细胞。并使之分裂生长成为杂种生物。在细胞水平上改变细胞遗传结构，从而培育具有新性状的生物个体或细胞群体。酶工程（enzymeengineeing）：酶工程是对酶进行开发、生产与应用的技术。是利用酶的特异催化功能，在常温常压下将一种物质转化为另一种物质，以获得高纯度的适用之物。微生物工程（Microbialengineering）又称发酵工程，是利用微生物生长代谢活动产生的各种生理活性物质来生产商品的生产技术。,6,发酵工程的意义,基因工程,酶工程,细胞工程,发酵工程,产物,产品,产品,蛋白质工程,产品,7,二、微生物工程的定义和特点,发酵（fermentation）原始发酵：英语中“发酵”一词是从拉丁语ferver派生而来的，原意为“发泡”。是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。现代含义：指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，是生物细胞为获取生长和生存所需能量而进行的以有机物作为电子受体的氧化还原反应（如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2）。,8,工业上的发酵:泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程,产品包括细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。按获取能量方式分厌氧发酵（如酒精，乳酸等）和好氧发酵（如抗生素、氨基酸、酶制剂等）按培养基物理性状分：液体和固体发酵按产物类型分初级代谢物发酵和次级代谢物发酵；按操作类型分自然发酵、纯种发酵、混种发酵、分批发酵、补料分批发酵、连续发酵。,9,1、微生物工程的定义,微生物工程是利用微生物的特定性状和机能，通过现代化工程技术，生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系。是将传统的发酵技术与现代的基因工程、细胞工程、代谢工程、生物信息工程和计算机控制等技术结合并迅速发展的现代发酵技术。是生物技术的基础，是生物技术产业化的重要组成部分。它将微生物学、生物化学、化学工程的基本原理有机结合起来，是一门利用微生物的生命活动来生产人们所需要的有用物质的工程技术。,10,（1）微生物工程的一般特点：生产所用的原料通常以淀粉、糖蜜等碳水化合物为主，辅料包括一定的有机或无机氮源和少量无机盐。可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改造和更新。微生物反应过程以生命体的自动调节方式进行，数十个生化反应过程能通过单一微生物的代谢活动来完成，因而所需产品可在单一发酵设备中一次合成。,2、微生物工程的特点,11,微生物能利用简单的物质合成复杂的高分子化合物。酶制剂、活性蛋白、活性肽和多糖等生物产品的生产是微生物工业最有发展前景的领域。由于生命体特有的反应机制，微生物能高度选择性地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团导人等转化反应，从而获得某些具有重大经济价值的物质。,12,微生物在自然界中分布很广，种类繁多。人们可有目的地从自然界中筛选有用的微生物菌种，并可通过物理和化学诱变、细胞融合和基因重组等育种技术获得高产菌株。并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。从分子生物学的观点看，微生物的基因组相对较小，调控系统相对简单，进行基因操作比动、植物要容易得多。例如最初从微生物生产青霉素时，其产率不到0.01%，经过人们的不断改造，今天已达5以上，产率提高了500多倍。,13,（2）与化学工程相比，微生物工程的特点为：,作为生物化学反应，通常在常温常压下进行，因此没有爆炸之类的危险，各种生产设备一般不必考虑防爆问题。微生物发酵过程需防止杂菌污染，生产过程所需的设备、培养基和空气都需进行严格的无菌处理，一旦杂菌入侵就有可能导致发酵生产的失败。尤其要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。微生物发酵液成分较复杂，大多为非牛顿流体，其产品分离与纯化过程比化学反应过程产品复杂得多。,14,制造发酵产物的微生物菌体也是发酵产物，微生物细胞富含蛋白质、核酸、维生素等有用物质。微生物发酵液一般不含对生物体有害的物质。在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；种子培养和生产培养的不同的工艺技术。而且在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。,15,（3）与生物工程的其他技术相比，微生物工程的特点为：,与酶工程相比，微生物工程的特点是微生物的来源广、价格低，而且可以再生，但发酵液中含有一定副产物，给产品提取与纯化带来困难；而酶催化反应专一、无副产物、转化率高，但原酶价格高，有些酶来源受限制，且酶失活后不能再生。有关微生物工程与酶工程的比较见表11与动、植物细胞培养比较，微生物具有极强的消化能力和繁殖能力、营养要求简单、对环境条件（温度、压强、渗透压、酸碱度等）有极强的适应能力。有关微生物培养与动、植物细胞培养的差异见表12。,16,表11,17,表12,18,三、微生物工程的组成,从广义上讲，由三部分组成：上游工程、发酵过程、下游工程,上游工程UPSTREAMPROCESSES,下游工程DOWNSTREAMPROCESSES,-genetics,cell-inoculumdevelopmentmediaformulationsterilization-inoculation,productextraction,purification&assaywastetreatmentbyproductrecovery,19,六个基本组成部分,1、用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制；2、培养基、发酵罐、空气以及辅助设备的消毒灭菌；3、菌种与种子扩大培养，将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中；4、发酵过程控制，将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物；5、发酵产品下游加工过程：可分为发酵液预处理、初步纯化，高度纯化和成品加工四个部分，所用的单元操作包括絮凝、固液分离、细胞破碎、沉淀、吸附、膜分离、萃取、离子交换、电泳、结晶、色层分离、浓缩、干燥、包装等；6、微生物发酵过程中产生的废物和废水的回收或处理过程。,20,发酵的流程,21,典型工艺及设备流程,22,菌种筛选,摇瓶试验,发酵罐试验,23,四、微生物工程发展简史,1、传统的微生物发酵技术天然发酵酿酒、食醋、酱油；豆豉、酱、泡菜、干酪、面团发酵、腐乳等。,远古人类发现，吃剩的米粥数日后变成了醇香可口的饮料人类最早发明的酒,24,我国古代的酿酒作坊（四川新都县出土的汉代画像）,25,2、第一代微生物发酵技术纯培养技术的建立,1680年列文虎克制成显微镜证明了微生物的存在。,26,1857年，巴斯德（LouisPasteur）微生物之父证明了酒精是由活的酵母发酵引起的。并提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变（巴氏消毒）。同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。,27,1897年德国化学家毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精酶。1907年获得诺贝尔化学奖在此基础上，与微生物相关的维生素、酶、抗生素等研究蓬勃发展。,(EdwardBuchner，1860-1907),28,1905年，柯赫建立微生物纯培养技术，为微生物学的发展奠定了基础。科赫的固体培养基也是微生物学研究史上的一大突破。他受土豆片(potatoslice)的启发，将动物明胶(gelatin)加入牛肉汁中制成人工固体培养基。但明胶会被一些细菌分解或由于温度太高而液化。科赫实验室的工作人员FannyEilshemius提出采用琼脂(agar)为固体培养基的固化剂，并很快被采纳。从而使她有幸成为第一位为微生物学做出贡献的美国人；同期，科赫的另一位助手RichardPetri发明了培养皿，又称Petri皿。在培养皿中制成的固体培养基被称为平板（plate）。科赫和其同事还发明了细菌染色法、显微镜摄影技术和悬滴培养法等细菌学研究的必备技术。,29,划线法获得单菌落,蘸取混合的细菌培养物在固体培养基表面划线（streak），经培养后，使它们在表面形成一个个单菌落（singlecolonies）（见右图)。挑取不同形态的单菌落分别在新培养基上划线培养，若新平板上出现的菌落都是形态相同的，就说明已获得了该菌的纯培养物。这样就使混合培养物中不同细菌得到了分离。,30,科赫（左）及其研究工具：钟罩(A)用来培养微生物，照相设备(B)、显微镜(C)、染料和其它化学试剂(D)。科赫提出了指导特定微生物与特定疾病相关性研究的科赫定理（Kochpostulate）：1905年由于发现了肺结核病的病原菌；而获得诺贝尔医学奖。,31,3、第二代微生物发酵技术深层培养技术（机械搅拌通气技术）,好氧发酵技术：1815-1826年Schiitzenbach用速酿法从乙醇生产醋酸，1879年Marquardt用通气法大量繁殖酵母，1904年用米曲霉的麸曲代替麦芽糖作糖化剂生产酒靖，用微小毛霉生产干酪。20世纪初期，1916年英国的Weizmann采用梭状芽孢杆菌生产丙酮丁醇，德国采用亚硫酸盐法生产甘油（第一次世界大战）由食品工业向非食品工业发展；1933年Luyver等人发明了摇瓶培养法代替了传统的静置培养法。生长均匀，增殖时间短。,32,1929年由Fleming发现青霉素，二十世纪四十年代初，第二次世界大战爆发，1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究，1945年，发明了大型的搅拌型发酵罐培养法，并迅速形成工业大规摸生产。表面培养：1升扁瓶或锥形瓶，内装200mL麦麸培养基40u/mL，1943年沉浸培养：5m3200u/mL，当今：100m3200m35-7万u/mL。,33,AlexanderFleming(1881-1955),1929年，弗莱明发现医学界称为“魔弹”的药物-青霉素。他的发现极其偶然，一天早上，弗莱明发现留在工作台上的一些葡萄球菌培养物被某种污染的东西杀死了，留下一些空圈，他马上进行检查，发现是普通面包上的青霉菌能分泌抑制其它微生物生长的毒素。他将这种物质称为“Penicillin”(盘尼西林，即青霉素)，但未能使之分离纯化和应用。,污染的霉菌菌落对金黄色葡萄球菌的拮抗作用拮抗现象导致青霉素的发现,34,1943年，钱恩和弗路里使青霉素批量化生产并成功地应用在突尼斯和西西里战役中500名伤兵治疗。1945年，三人同时获得诺贝尔医学奖。,35,SelmanA.Waksman(1888-1973,美)放线菌及链霉素的发现者，获得1952年诺贝尔医学和生理学奖,1944年美国微生物学家瓦克斯曼(S.Waksman)从近一万株土壤放线菌中找到了疗效显著的链霉素。接着相继发现了氯霉素、金霉素、土霉素、红霉素、新霉素、万古霉素、卡那霉素和庆大霉素等抗生素。如今的抗生素家族已有了上万名成员。,36,主要的技术进展：通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。抗杂菌污染的纯种培养技术：无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。意义：抗生素工业的发展；建立了一套完整的好氧发酵技术，大型搅拌发酵罐培养方法；推动了整个发酵工业的深入发展；为现代发酵工程奠定了基础。,37,大型发酵罐（下）及其搅拌装置（右）,38,180M3发酵罐车间,大型空气压缩机,39,发酵车间的空气过滤器,40,41,人工诱变育种与代谢控制技术:,人工诱变育种是采用物理、化学或生物的方法使微生物细胞的遗传物质发生基因突变，并通过筛选，从而获得性状更为优良的菌株；代谢控制技术对微生物具有高度专一性的酶反应作为合成手段的一部分加以利用，进行合理的代谢。如利用微生物进行甾体化合物的转化，Glu和Lys发酵生产等。,42,4、第三代微生物发酵技术微生物工程,细胞融合技术、基因操作技术等生物技术发展，打破了生物的种间障碍，能定向地制造出新的有用的微生物。,动物细胞反应器,采用酶学的方法，将不同来源的DNA进行体外重组，再把重组DNA设法转入受体细胞内，并进行繁殖和遗传下去。人们能够根据自己的意愿将微生物以外的基因件导入微生物细胞中，从而达到定向地改变生物性状与功能创新的物种，使发酵工业能够生产出自然界微生物所不能合成的产物。,43,44,发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包，发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。,45,五、微生物工业,（一）微生物工业产品的类型1、以微生物细胞为产物的发酵工业2、以微生物代谢产物为产品的发酵工业3、以微生物酶为产品的发酵工业4、生物转化或修饰化合物的发酵工业5、微生物废水处理和其他,46,微生物产物：微生物细胞，酶，药物活性物质，特殊化学物质和食品添加剂,47,1、生产微生物细胞物质,定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类，大型食用或药用真菌（菇类、冬虫夏草等），生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。,48,2、微生物酶发酵,酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺、提高产量。分类：胞内酶和胞外酶（如淀粉酶、糖化酶等）生物合成特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。,49,3、微生物代谢产物发酵,包括初级代谢产物、中间代谢产物和次级代谢产物。对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期（即稳定期）所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。微生物在第一次生长代谢过程中（对数生长期）不产生目标产物，目标产物在第二次代谢中（稳定期）形成的具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、生长促进剂等。,50,4、微生物的生物转化,定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更大经济价值的化合物（如将乙醇转化为乙酸、Vc等）。最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。,51,5、微生物特殊机能的利用,利用微生物消除环境污染利用微生物发酵保护生态环境微生物湿法冶金利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域。,52,（二）微生物工业的应用,1在食品工业中的应用2在医药卫生中的应用3在轻工业中的应用4在化工能源产品中的应用5在农业中的应用6在环境保护中的应用7在细菌冶金中的应用8在高技术研究中的应用,53,1在食品工业中的应用食品加工；含醇饮料；发酵乳制品；调味品和发酵食品；甜味剂；食品添加剂；食品检验2在医药卫生中的应用抗生素：抗细菌抗生素，抗真菌抗生素，抗原虫抗生素，抗肿瘤抗生素，起免疫抑制作用的抗生素，半合成抗生素。,氨基酸；维生素；甾类激素；生物制品；治疗用酶；酶抑制剂；其他核苷酸类，基因工程药物。3在轻工业中的应用糖酶；蛋白酶；果胶酶；脂肪酶；凝乳酶；氨基酰化酶；甘露聚糖酶；过氧化氢酶,54,4在化工能源产品中应用醇及溶剂；有机酸；多糖；烷烃；清洁能源；5在农业中的应用生物农药：微生物杀虫剂；防治植物病害微生物。生物除草剂；生物增产剂；食用菌和药用真菌。,6在环境保护中的应用厌气发酵法；好气发酵法7在细菌冶金中的应用氧化亚铁硫杆菌把亚铁氧化为高铁，把硫氧化为硫酸8在高新技术研究中的应用基因工程、医学诊断和工业过程检验的生物传感器、生物芯片等。,55,六、微生物工程的现状和发展趋势,微生物工程的现状目前，全球发酵产品的年销售额在400亿美元左右，并以每年约78的速率增长。我国发酵行业生产企业有5000多家，主要发酵产品的年产值高达1300亿元。发酵工程技术给人类社会生产力的发展带来了巨大的潜力；涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与