微生物工程第四组

工程酿酒酵母从头生产黄酮类化合物：柚皮素,第四组,纲要,1、研究背景及目的2、研究原理3、研究方法及结果分析4、讨论5、研究进展及展望,黄铜类化合物简介：,黄铜类化合物广泛存在与植物体内，有重要的生理活性，近年来研究其具有多种药理活性：对心脑血管系统具有保护作用，如金丝桃苷对缺血性脑损伤有保护作用、沙棘总黄酮对心肌缺血性损伤有保护作用；抗菌及抗病毒活性；抗肿瘤活性；大多数黄酮类化合物均有较强的抗氧化自由基作用，抗炎、镇痛、保肝作用等。,一、研究背景及目的,黄酮类化合物是植物次生代谢产物，表现出各种各样的抗氧化能力等药理活性与人体健康相关，包括癌症、糖尿病、肥胖症和帕金森氏病等。植物生产类黄酮具有低生产率、由于其分子的复杂性分离提取困难等特点；因此，为了克服这些限制，在代谢工程中，设想利用微生物系统的特定代谢途径来生产大量的单一分子。,二、研究原理及方法,（一）在酵母中工程化生产柚皮素途径的原理示意图：拟南芥相关基因过表达：PAL1（苯丙氨酸解氨酶），C4H（肉桂酸4-羟化酶），CPR1（细胞色素P450还原酶），4CL3（4-香豆酸辅酶A连接酶），CHS3（查耳酮合酶）和通道1CHI中（查耳酮异构酶）和荚膜红细菌一个基因;TAL1（酪氨酸丙氨酸解氨酶）。虚线表示的反馈抑制。灰色箭头表示酵母生产苯乙醇的途径。大的深灰色箭头表示柚皮素的生产途径。拟南芥Aro3/Aro4：3-脱氧-D-阿拉伯-heptulosonate-7-磷酸盐（DAHP）合酶，PDC1，5，6;丙酮酸脱羧酶，Aro10;苯丙酮酸脱羧酶。,研究的目标是规定一种代谢工程策略：用葡萄糖作为唯一碳源,由啤酒酵母从头生产柚皮素。,基因的选择（关键）,选取几个在酵母柚皮素途径中异源表达的几个基因：黄铜类生物合成基因4CL3、CHS1、CHI1以及源于木质素的C4H和PAL1基因。而PAL1和CHI1分别优于PAL2与CHI3,因为它们的表达模式与C4H和4CL3有更强的相关性。,拟南芥候选基因A中黄酮类化合物生物合成的共表达分析：。实线表示的表达高于0.7皮尔逊相关系数，虚线表示0.6和0.7之间的皮尔逊相关性。,三、实验方法及结果分析,1、橘皮素基因的构建与评价构建的优化后的酵母菌株为IMU011（质粒pUDE172）在含有以葡萄糖为唯一碳源合成培养基的摇瓶培养，该菌株产生的橘皮素浓度在5.4M（见后图）。柚皮素浓度在细胞外测定得到，但其运输机制尚未阐明。,2、酵母中酪氨酸的减轻对DAHP的反馈抑制调节构建酿酒酵母菌株为IMX183；特点：将酪氨酸不敏感等位基因ARO4与其缺失了DAHP合酶（ARO3）等位基因结合地导入受体菌能够引起芳香族氨基酸的四倍产量。目的：测试这种遗传干预对柚皮素合成的潜在影响。,测试结果：使得摇瓶中柚皮素滴度的2倍增加（10.4M），这种增长是伴随着苯乙醇的积累，其胞外浓度增加约100倍的水平，为柚皮素浓度20倍甚至更高。,3、消除竞争性苯丙酮酸脱羧酶活性机制：苯丙酮酸脱羧酶依赖的2-氧代酸焦磷酸硫胺素可通过ARO10，PDC1，PDC5和PDC6编码。本文研究人员证实：PDC1和PDC6对苯丙酮酸的亲和力和脱羧速率比PDC5，尤其是Aro10低得多。（考虑到葡萄糖的利用）（1）构建了含有PDC1、aro10的酿酒酵母菌株：IMX185（2）构建了含有PDC1的酿酒酵母菌株：IMX106,（）IMU011（atPAL1，coC4H，coCPR1，atCHI1，atCHS3，at4CL3），（）IMX183（aro3ARO4G226SatPAL1，coC4H，coCPR1，atCHI1，atCHS3，at4CL3），（）IMX185（aro3ARO4G226SPDC5，PDC6，atPAL1，coC4H，coCPR1，atCHI1，atCHS3，at4CL3），（）IMX106（aro3ARO4G226Saro10，PDC5，PDC6，atPAL1，coC4H，coCPR1，atCHI1，atCHS3，at4CL3），（）非柚皮素生产标准株CEN.PK2-1C。误差线表示标准偏差。,4、减轻香豆酸在下游的瓶颈机制：柚皮素查耳酮合酶通过催化缩合香豆酰-CoA与丙二酰辅酶A形成三个分子的查耳酮，它是已知的具有低催化活性的酶。因为在下游反应中香豆酸限制了柚皮素的产生。将两个coCHS3基因的拷贝引入IMX106的质粒（pUDE188）上生产出IMX197菌株。,5、酪氨酸解氨酶(Tal1)的表达可柚皮素合成增加机制：因为啤酒酵母苯丙氨酸与酪氨酸不能互相转换使得酪氨酸不能被利用来生产柚皮素。将荚膜红细菌中cotal1基因的整合到工程菌株IMX197中，产生的菌株为IMX198。,6、柚皮素生产有氧控制下分批培养酿酒酵母IMX198是需氧生长于葡萄糖分批培养，酒精发酵是葡萄糖代谢的主要模式。,7、菌种和保存所有菌株均来自酿酒酵母CEN.PK株。培养的菌种在30500毫升烧瓶摇，培养物包含100ml含20gL-1的葡萄糖合成培养基与适当的生长因子来补充菌株的特定营养缺陷型需求。过夜生长后，最终浓度含20甘油，并予1ml等份保存在-80,研究材料,1、菌种,2、基因的改造及质粒的构建,3、培养基和介质(1)大肠杆菌生长在37的Luria肉汤培养基含有适当抗生素，100微克L-1氨苄青霉素或50微克L-1卡那霉素。(2)酿酒酵母生长在30下的培养基中，含有软化水，将20gL-1的葡萄糖，5克/升（NH4）2SO4，3克升-1KH2PO4、0.5克升-1MgSO4干燥。7H2O，维生素和微量元素，将培养基的pH用KOH设置为6.0和适当的生长因子，营养缺陷型菌株的要求增加150毫克L-1为尿嘧啶，500毫克L-1为亮氨酸，75毫克L-1为色氨酸和125毫克L-1为组氨酸。,四、讨论,1、来源于单一植物的共表达异源基因有益于柚皮素的生产的观察，是否可以支持维持供体特异性蛋白质-蛋白质相互作用可以提高通路动力学和特异性的假说。2、正如前面所讲到的：去除反馈抑制也导致苯丙氨酸过表达途径，因此可以作为主要生产苯乙醇副产物。,3、在柚皮素生产酿酒酵母菌株中，该副产物phloretic酸产生浓度类似于达到的柚皮素，但其形成的机制尚不清楚。4、在整个试验中，都涉及到相关基因的改变，是否增加丙二酰辅酶A的可用性，有利于柚皮素的生成，因此提供了进一步研究的目标。,五、研究进展及展望,本研究成功地让苯乙醇副产物的形成减少，而黄酮类似物增多