生物工程分析的基础知识课件

第2章生物工程分析的基础知识,2.1概述2.2分析样品的采集、制备及保存2.3样品的预处理2.4生物工程分析的评价1.误差及分析方法的选择2.数据处理与质量控制,2.1概述,1.样品分析流程:样品的采集、制备和保存样品预处理成分检验与分析数据处理整理报告,2.2分析样品的采集、制备及保存,2.2.1样品的采集1.定义:从大量的分析对象中抽取有代表性的部分样品作为分析样品的工作。2.正确采样，必须遵守的原则：代表性（一）.采集的样品要均匀，有代表性，能反应全部被测生化产品的组份，质量和卫生状况；(正确划分取样单元和确定取样点是十分重要的)（二）.采样过程中要设法保持原有的理化指标，防止成分逸散或带入杂质。,（三）采用的一般程序,1.颗粒状样品(粉状生化产品)对于这些样品采样时应从某个角落，上中下各取一类，然后混合；用四分法得平均样品。2.半固体样品（如蜂蜜，稀奶油）用采样器从上中下分别取出检样混合后得平均样品。,（四）采样的数量与方法,采样工具,套筒式采样器,3.液体样品液体样品，先混合均匀，用吸法分层取样每层取500ml，装入瓶中混匀得平均样品。4.小包装的样品对于小包装的样品是连包装一起取（如罐头，奶粉）一般按生产班次取样，取样数为1/3000，尾数超过1000的多取1罐，但是每天每个品种取样数不得少于3罐。5.不均匀的样品,6.生物活性样品的采集:(1)生物材料的采集尽可能地接近正常状态下获得组织和器官。必须快速，及时速冻、低温保存(2)血样采集用得较多的方法是静脉采血(3)尿样通常取在规定时间内的尿液(4)唾液采样一般是在漱口后15min,收集口内自然流出或舌在口腔内搅动后流出的混合唾液,2.2.2样品的制备,1.样品的制备目的：使样品充分代表待测样品的性质2.样品的制备(粉碎、混匀和缩分）方法：摇动或搅拌（液体样品，浆体，悬浮液体）（用玻璃棒、电动搅拌器、电磁搅拌）切细或搅碎（固体样品）研磨或用捣碎机目前一般都用高速组织捣碎机进行样品的制备。,2.2.3样品的保存,防吸水或失水、霉变、高温分解、失活、细菌等,1.鲜样如不能立即测定，则须放在冰箱中(-5)短期冷藏保存，以抑制其生理变化。,2.新鲜的动物样品取样后，一般采取冷冻保存（20），或采用超低温保存（70），或采用液氮冷冻保存，以防止蛋白质及脂肪发生变化。,2.3样品的预处理,一.预处理目的:排除测定干扰因素；浓缩测定物质(1)提高灵敏度和降低检测限(2)提高测试精度(3)提高方法的选择性(4)使样品易保存和运输(5)延长测试仪器的使用寿命,二.样品预处理的评价准则:(1)是否能最大限度地除去干扰物(2)被测组分的回收率是否高(3)操作是否简便、省时(4)成本是否低廉(5)对人体和环境是否产生影响,三.预处理方法分类：1.溶解法2.蒸馏法3.有机物破坏法干法灰化湿法消化4.溶剂提取法溶剂分层法浸泡法盐析5.色层分离法6.其它的生化分离提纯技术,(一）蒸馏法利用液体混合物中各组分挥发度的不同分离为纯组分的方法叫蒸馏。（1）常压蒸馏当被蒸馏的物质受热后不发生分解或在沸点不太高的情况下，可在常压进行蒸馏。,（2）减压蒸馏当常压蒸馏容易使蒸馏物质分解，或其沸点太高时，可以采用减压蒸馏。减压装置可用水泵或真空泵。（3）水蒸汽蒸馏将水和与水互不相溶的液体一起蒸馏，这种蒸馏的方法就成为水蒸汽蒸馏。（4）分馏分馏是蒸馏的一种，是将液体混合物在一个设备内同时进行多次部分汽化和部分冷凝，将液体混合物分离为各组分的蒸馏过程。这种蒸馏方法用于这种混合液体，即它的两种或两种以上组分是可以互溶而且沸点相差很小的。,在高温或强氧化条件下，使样品中有机物质分解，并在加热过程中成气态而逸散掉。可分为干法灰化和湿法消化两大类。2.3.3.1干法灰化:是一种用高温灼烧的方式破坏样品中的有机物的方法，又称灼烧法。样品在灰化炉中（一般550摄氏度）被充分氧化。为了避免测定物质的散失，往往加入少量碱性或酸性物质（固定剂），通常称为碱性干法灰化或酸性干法灰化。,（二）有机物破坏法,具体预处理方法,干法灰化优点基本不加或加入很少的试剂，故空白值低。因灰分体积小，因而可处理较多的样品，可富集被测组分。有机物分解彻底，操作简单。,缺点所需时间长。因温度高易造成易挥发元素的损失。坩埚对被测组分有吸留作用，使测定结果和回收率偏低。,灰化操作注意事项：（1）灰化前样品应进行预炭化。（2）样品炭化、加硝酸溶解残渣等操作应在通风橱内进行。（3）高温炉内各区的温度有较大的差别。（4）应根据待测组分的性质，采用适宜的灰化温度。,（5）采用瓷坩埚灰化时，不宜使用新的，以免新瓷坩埚吸附金属元素，造成实验误差。（6）如样品较难灰化，可将坩埚取出，冷却后，加入少量硝酸或水湿润残渣，加热处理，干燥后再移入高温炉内灰化。（7）湿润或溶解残渣时，需待坩埚冷却至室温方可进行，不能将溶剂直接滴加在残渣上。,（8）从高温炉中取出坩埚时，避免高温灼伤。（9）坩埚从炉内取出前，先放置于炉口冷却，并在耐火板上冷却至室温。切忌直接置于木制台面、有机合成台面上以免烫坏台面，也不宜直接置于导热系数较高的台面上，以免陡然遇冷引起坩埚破裂。,2.3.3.2湿法消化法,原理：样品中加入强氧化剂，并加热消煮，使样品中的有机物质完全分解、氧化，呈气态逸出，待测组分转化为无机物状态（离子态）存在于消化液中。常用的强氧化剂有浓硝酸、浓硫酸、高氯酸、高锰酸钾、过氧化氢等。,优点：有机物分解速度快、处理时间短、方法得当时，元素无损失、缺点：产生有害气体；需随时照管（初期易产生大量泡沫外溢）；试剂用量较大，空白值偏高、,按消化措施分：1.敞口消化法2.回流消化法3.密封罐消化法4.微波消解法,2.3.3.3微波消解法又称为“微波辅助化学消解”使用程序化的微波湿法消化器，系统可以程序升温，先脱水，然后湿法消化，同时可控制真空度和温度，与马福炉相比缩短了灰化时间，如面粉的微波湿法灰化只需1020min。对于植物样品(除铜的测定外)，用微波系统灰化20min就足够了，而要得到类似的结果，用马福炉则需要40min4h。,（三）溶剂提取法在任一溶剂中，不同的物质具有不同的溶解度，利用混合物中各物质的溶解度的不同，将混合物组分完全或部分地分离，此过程叫萃取，也称提取。（1）溶剂分层法,（2）浸泡法从固体混合物或有机体中提取某种物质时，一般采用浸泡法，所以这种方法称为浸提。常用的是索克斯特式提取器（简称索氏提取器）。（3）盐析法向溶液中加入某一物质，使溶质溶解在原溶剂中的溶解度大大降低，从而从溶液中沉淀出来，这个方法叫作盐析。,（四）色层分离法柱层析法是净化抽提液中杂质的最通用的方法。在使用此法时调整吸附剂的活性及选用极性强弱适宜的溶剂是净化成败的关键。柱层析法有吸附柱层析法和分配柱层析法。吸附柱层析法常用氧化铝、活性碳和硅胶等作吸附剂；分配柱层析法常用硅藻土和弗罗里矽土等做担体。薄层层析,（五）浓缩,浓缩过程应注意防止氧化分解，尤其是在浓缩至近干的情况下，更容易发生氧化、分解，这时往往需要在氮气流保护下进行浓缩。常用的浓缩的方法有：1、蒸馏或减压蒸馏方法浓缩2旋转蒸发器浓缩3.KD浓缩器浓缩4吹蒸法5提取一浓缩联合装置样品的前处理方法很多，实际运用中，需综合考虑，灵活运用,2.5误差及分析方法的选择,一.分析方法的评价指标在研究一个分析方法的好坏时，通常用精密度、准确度和灵敏度三项指标评定。此外还考虑线性和线性范围、耐用性、选择性等。,1.精密度：是指对同一样品多次测定，每次测定结果与均值的符合程度。是表示测定结果中随机误差大小的指标。表示精密度的指标有标准偏差（S）、变异系数（CV）、平均偏差等。评价精密度的方法有平行试验和重复性试验。,2.准确度：指测定值与真值之间的符合程度。往往以不准确度来衡量，即重复测定的均值与真值之差。准确度主要受系统误差支配，也受随机误差的影响。评价准确度的方法有回收试验、干扰实验、对比试验。,3.灵敏度：是指分析方法所能检出的最低量。4.特异性：指分析测定中对某一成分起反应，其他物质对反应无影响或基本无影响。评价特异性的方法有干扰试验。5.线性范围：是指能达到一定精密度、准确度和线性前提下，测试方法所适应的高、低浓度或量的区间。通过线性试验确定。6.耐用性:指在测定条件下有小的变动时,分析相同的样品所测得试验结果的重现程度。,二.实验误差的表示方法,(1),（3）变异系数（CV）(相对标准偏差):是样本标准偏差与样本均数的百分比值。用于比较各组数据间的变异情况，不受单位影响，CV值越大，说明测定值离散度越大，精密度越差。,（2）标准偏差(均方根偏差)，用S表示。是表示精密度的较好指标。,（4）数据理论评估标准偏差,质量控制图,在工业生产的质量控制和日常分析测试数据的有效性时,常用质量控制图。,回归曲线,三.提高分析精确度的方法(控制和消除误差的方法),1.正确选取样品的量2.增加平行测定次数3.对照实验4.空白实验5.回收实验6.校正仪器和标定试剂7.严格遵守操作规程8.水质的要求,continue,3.对照实验:标样与测样结果对照;不同人员检验结果对照可检测方法的系统误差4.空白试验：不加入待测样品，其它的测定过程、方法和试剂均与测定样品相同的试验。可抵消由于试剂中杂质的干扰等因素造成的系统误差。,回收试验:目的是衡量分析方法的准确度。1.方法:在样品中加入一定量被测物质，然后用同样方法测定，测得值与理论值之比乘以100%即为回收率，合格的回收率应为100%5%。2.计算,回收浓度分析标本测得浓度基础标本测得浓度,100,%,5.回收实验,back,水质的要求,由于普通蒸馏水含有CO2，挥发性酸、氨和微量元素金属离子等，所以进行灵敏度高的微量元素的测