生物工程制药之维生素生产工艺6

生物制药工艺（维生素生产工艺）,维生素生产工艺,2.7维生素B2生产工艺2.7.1维生素B2的国内外生产现状目前维生素B2的全球需求量在800010000吨，随着中国、南美等国家饲料业的不断发展，在未来35年内还会进一步提高。但生产商利润率降低，使许多公司不得不集中力量理顺生产和降低生产成本。由于采用发酵工艺比采用化学合成工艺有更大的降低生产成本空间，因此，生产商对发酵法维生素B2生产更加重视。饲料仍将是维生素B2最重要的市场，市场份额为50%左右，医药和食品约为30%，其他如保健品等市场份额为20%，。维生素B2产品根据其纯度分为医药级（纯度98%）、食品级（96%）和饲料级（VB280%）。,2.7.2维生素B2生理功能和基本性质2.7.2.1关于维生素B2商品名：维生素B2化学名：核黄素（riboflavin），6,7-dimethyl-9-(1-D-ribityl)isoalloxazine。分子式：C17H20N4O6分子量：376.38结构式：,维生素生产工艺,维生素B2又称维生素G或核黄素。维生素B2是黄色针状晶状，微溶于水，遇碱易降解，遇光也容易分解。熔点：275-280溶解度：等电点：6.0,维生素生产工艺,维生素生产工艺,1879年英国化学家布鲁斯首先从乳清中发现VB2。Kuhn等于1933年首次从酵母、蛋清和乳清中分离出纯的核黄素，并于1935年人工合成核黄素。因其结构中含有核糖且呈黄色,故取名核黄素。VB2它在动物机体内含量微少,是维持动物良好营养状况和生产性能所必需的营养物质。,维生素B2的主要功能是在氨基酸、脂肪酸和碳水化合物的代谢中起作用，是生命活动极其重要的物质，人体及家禽、家畜体内不能合成维生素B2，必须从外界摄取。人缺乏维生素B2将导致口角炎，舌炎，眼炎、结膜炎、阴囊炎等维生素B2缺乏症。而动物缺乏维生素B2将导致生长发育迟缓、皮炎、神经失调、食欲不振、生育不良等症状。,维生素生产工艺,维生素B2产品广泛应用于饲料添加剂、营养食品添加剂和着色剂、临床用药、保健、美容及化妆品等领域。此外，新的用途不断被开发，维生素B2在治疗心绞痛、防治偏头痛、治疗慢性肾炎水肿和治疗某些癌症等方面也日益受到人们的注意；酪酸脂(以维生素B2为原料生产)，在日本广泛用于治疗动脉硬化、高血压、糖尿病等顽固的慢性疾病，且有良好反应；发达国家将维生素B2用于污水处理也有报道。,维生素生产工艺,猪用添加预混料配方（美国大豆协会制定）,维生素生产工艺,维生素生产工艺,2.7.3维生素B2生产方式维生素B2可以采用微生物发酵和化学合成两种方法生产2.7.3.1全化学合成法全化学合成法以葡萄糖为起始原料，工艺路线复杂，生产成本高，而且所用到的原料中含有二甲苯等有毒物质，对环境的污染严重，已经在核黄素的工业化生产中逐渐被淘汰.,2.7.3维生素B2生产方式2.7.3.2化学半合成化学半合成核黄素的关键中间体为D-核糖（多采用细菌发酵将葡萄糖转化），较早的合成途径是D-核糖经氧化等4步化学反应，合成得到核黄素，之后又有化学家将其简化成3步。具体合成路线为：D-核糖乙醇溶液（1）制备后，在一定氢压存在的条件下,使（1）和3,4二甲苯胺或4硝基邻二甲苯反应，得到N-D-核糖醇基-3,4-二甲苯胺（2），（2）再和苯胺重氮硫酸盐(或盐酸盐)反应，得到（D-核糖胺基）-6-偶氮苯基-3,4-二甲苯（3）。此后,在酸性缩合剂存在的条件下，使（3）和巴比妥酸反应，制得最终产物核黄素(4)。,维生素生产工艺,维生素生产工艺,发酵方法发酵生产的菌种主要包括Bacillussubtilis,Ashbyagossypii(核黄菌),Eremotheciumashbyii(阿氏假囊酵母)等，这些构建的微生物基因工程菌在合适的培养基上均可以产生核黄素，多为外分泌，过程采用液体深层发酵。目前发酵方法生产维生素B2比化学合成的方法更具优势，尤其是生产饲料级维生素B2，选择全发酵法成本更低。,Bacillussubtilis由于具有下面几个优点而被选作构建生产核黄素的基因工程菌的出发菌株。1Bacillussubtilis是一种非病原微生物，总的来说，许多由这种微生物生产的产品被认为是安全可靠的。2Bacillussubtilis是革兰氏阳性菌中一种具有代表性的模式菌株，由英、法、德、日、瑞士等八个国家联合完成的枯草芽孢杆菌基因组计划（BacillussubtilisGenomeProject），将枯草芽孢杆菌基因组的全部4,214,810个碱基完全测序并公开发表，包括2,379个基因的枯草杆菌基因图谱也已绘制完成并发表，其中相当一部分基因及其编码蛋白的分子生物学信息已经获得，为枯草芽孢杆菌的基因工程改造、构建具有重要工业应用价值的工程菌株提供了详细的背景资料。Bacillussubtilis中的核黄素合成基因在其染色体的210形成一个单一的核黄素操纵子结构。,维生素生产工艺,维生素生产工艺,3.通过经典的诱变育种技术，Bacillussubtilis已经被成功地用于肌苷和鸟苷的工业化生产，产量可达20-40g/L。由于这些产品是合成核黄素的前体物，这显示了Bacillussubtilis具有良好的用于工业化生产核黄素的潜力。,维生素生产工艺,发酵主要原材料发酵原材料主要包括糖或淀粉类糖化液、玉米浆、酵母粉、磷酸盐等。提取原料主要为去离子水、无机酸和碱等。生产周期：种子培养14小时，发酵50-60小时；生产效价：16-18g/L，提取收率90%。,维生素生产工艺,维生素生产工艺,维生素生产工艺,VB2代谢途径,2.7.4维生素B2代谢途径,维生素生产工艺,核黄素是异咯嗪的衍生物，在异咯嗪环的7,8位上有两个甲基，10位N上连着一个核糖醇。关于核黄素的生物合成过程，不同种类的生物中并不完全相同。目前对大肠杆菌、枯草芽袍杆菌以及一些酵母中的核黄素合成途径了解得比较清楚。在枯草芽抱杆菌中核黄素的合成从GTP开始共包括6个反应。如图(Perkins,2002)所示:,维生素生产工艺,维生素生产工艺,2.7.5核黄素合成过程中所涉及的酶以及编码这些酶的基因在枯草芽抱杆菌中核黄素的合成共涉及4种酶蛋白(RibA,RibG,RibH,RibB)。其中RibA,RibG均为双功能酶。RibA同时具有GTP环化裂解酶和3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶的活性。因此一方面它起到GTP环化裂解的作用另一方面还可以催化5-磷酸核酮糖生成3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸(Richter,1997)。这一点与大肠杆菌不同。大肠杆菌中这两种酶分别由两个不同的基因编码并分别行使其功能。RibG则同时具有嘧啶脱氨酶和嘧啶还原酶的活性。,维生素生产工艺,RibH和RibB分别具有黄素合成酶亚基和黄素合成酶亚基的功能。现在除了导致核糖脱去磷酸的酶没有被鉴别出来之外，其余的酶均己被鉴定。表1为枯草芽抱杆菌中与核黄素合成相关的酶与基因(Perkins,2002)核黄素合成酶是一种复合酶，有轻酶和重酶两种。由3个亚基组成的酶为轻酶，重酶包括轻酶和60个亚基，其中轻酶处于60个亚基组成的衣壳中心。ribH编码核黄素合成酶的亚基，即二氧四氢蝶啶合成酶，分子量为16144，催化DHBP和ArP的缩合产生DRL。ribB编码核黄素合成酶的亚基，分子量为23333，催化2分子DRL发生歧化反应产生核黄素和ArP。,维生素生产工艺,维生素生产工艺,维生素生产工艺,维生素生产工艺,ribO是核黄素操纵子ribG基因上游存在的一个约300bp的非翻译区，也称为前导区，在早期对ribO的研究中发现其中含有一个不依赖因子的终止子（一个稳定的发卡结构后跟着6个U的残基）和一个位于5末端的8个核苷酸区域的反终止子，它与终止子发卡的“左翼”的是完全互补的。反终止子与终止子的左翼配对将会阻止发卡结构的形成，从而使转录能够顺利进行。,维生素生产工艺,反终止子位于终止子上游193个核苷酸处，这表明为了有效的与左翼竞争，需要通过特定的折叠而到达终止子处。该折叠为被称做rfn-box或RFN元件，为一特异性RNA结构的保守序列。该rfn-box特异的同FMN/FAD结合从而感知其浓度。当FMN/FAD的浓度的较高时，rfn-box与FMN/FAD结合形成一个复合物。该复合物的形成对于rib操纵子的调控是非常重要的，它可以改变RNA的构象，形成抗反终止子结构并阻止反终止子的形成，导致已经开始的转录在前导区提前终止，从而抑制核黄素的生成。,维生素生产工艺,破坏RFN元件的ribO突变株均可以解除FMN对核黄素操纵子转录的负调节作用，从而有利积累核黄素。,维生素生产工艺,维生素生产工艺,维生素生产工艺,2.7.6维生素B2的代谢调控和通量分析细胞代谢途径的实质就是与一组特定的流入和流出代谢物相联系的任何一个合理、可观察的生化反应序列，代谢工程利用重组DNA技术对细胞的酶反应、物质运输以及调控功能进行遗传操作，进而改良细胞的生物活性，它关注代谢途径的组合而非单一的反应，用整体、系统的观点考察完整的生化反应网络，重视途径和目标产物的热力学可行性、代谢通量及其控制。将代谢通量的定量分析方法与代谢通量控制的分子生物学技术完美结合在一起，合理地修饰生物细胞的遗传性状，是代谢工程的基石。系统研究代谢通量及其控制机制有三大基本步骤：（1）尽可能多地观察途径并测定其流量；（2）在代谢网络中施加一个已知的扰动，并确定系统达到新的稳态时的代谢通量；（3）系统分析代谢通量扰动的结果。若某个代谢通量的扰动对其下游代谢通量未能造成可观察的影响，那么就可以认为该处的节点对上游扰动的反应是刚性的，反之则为柔性。在刚性节点处，试图通过改变上游酶活性来影响下游代谢通量的做法是徒劳的。,维生素生产工艺,细胞内同时进行的数千个生化反应构成了错综复杂的细胞代谢网络体系，其中的各反应速率决定了整个网络的代谢通量，而这些反应的速率受相应的酶活水平以及参与反应的代谢物浓度的影响，它们同时又受细胞性状和所处环境的制约。代谢控制分析理论认为，代谢通量的控制是由组成代谢途径的各个步骤及相互之间的关系决定的，并且分布在整个代谢途径上。生物大分子和效应物并不能直接产生控制，而是通过作用于所在的反应而影响整个代谢系统的控制，限速步骤不是固定的，但系统控制系数的总和却是固定的，它可以定量描述各个步骤对整个代谢控制发挥作用的相对程度，从而使实验结果的解释更趋合理。,维生素生产工艺,代谢通量平衡一般包括三个部分：化学计量网络分析代谢通量分析同位素标记物分析,维生素生产工艺,维生素生产工艺,维生素生产工艺,维生素生产工艺,维生素生产工艺,维生素生产工艺,维生素生产工艺,维生素生产工艺,由定量描述确定的代谢网络可知，三种菌株中糖酵解途径的通量r7均大于戊糖磷酸氧化途径（pentosephosphatepathway,PPP）的通量r4，因此糖酵解是葡萄糖代谢的主要途径，大约有4550%的葡萄糖用于生物体的合成，2.5-8.5%的葡萄糖用于合成核黄素，在发酵过程中大约有0.52%的葡萄糖用于合成副产物乙酸，37%的葡萄糖通过丙酮酸合成其它有机物，在我们的分析测定中，这些有机物中主要为双乙酰，其含量约占3070%，副产物中几乎检测不到甲酸。,维生素生产工艺,一般认为PP途径的两个重要功能是提供还原力NADPH及前体物Ribulose-5-P和4-磷酸赤藓糖，24R7/pMX45中PPP的通量比较小，通量r6只有3.2%，前体物Ribulose-5-P几乎全用于合成核酸和核黄素，而在RH13pRB6340中虽然PPP的通量增加了10%，但其合成核黄素的通量却基本和24R7/pMX45相同。另外在RH33/pMX45中PPP的通量达到32%，这比其两株分别高约20%和10%，但其合成核黄素的通量仅增加了22.5%，通量分析的结果表明Ribulose-5-P的供给已经远大于合成核黄素的需要，仅仅通过增加r4很难使合成核黄素的通量增加，因此要进一步提高RH33/pMX45中核黄素合成的通量必须增加从Ribulose-5-P到核黄素的合成能力，其中主要包括提高GTP的合成通量和从GTP到核黄素的通量两个环节。,维生素生产工艺,将RH33/pMX45染色体上的pRB63进一步进行扩增以增加核黄素操纵子的剂量，然后将扩增后的菌株进行摇瓶发酵，结果扩增后菌株的核黄素产量并没有得到有效的提高。这表明RH33/pMX45中核黄素合成的主要通量限制因素可能存在于从Ribulose-5-P到GTP的一系列反应中。,维生素生产工艺,2.7.7维生素B2的提取工艺,VB2提取工艺路线（一）（1）用盐酸调发酵液pH到7，然后加热到70，维持45分钟；（2）将发酵液打入一个中间储罐，然后静置，冷却到20，然后将发酵液进行多次离心，第一次需要的离心条件是：离心力2500g3000g，最好是根据情况进行调整，以后的离心条件都是600g750g，根据实际情况进行调整。（3）离心后的固体加入到酸性的去离子水中，同时将悬浮液加热到120，搅拌并维持60分钟，然后冷却到80。离心过滤，得到的固体纯度可以达到96%。（4）如果此时的vb2做成饲料或添加剂，便可以进行