现代生物技术在发酵中的应用

微生物发酵技术在现代生物技术领域中的应用,2009-2010学年第二学期,南开大学生命科学学院,生物技术（biotechnology）又称生物工程或生物工艺学等。它是近代发展非常迅速的一门综合性科学技术，涉及许多科学领域。但从发展过程来看，它也是建立在微生物发酵工程的基础上，吸收新发展起来的基因工程、细胞融合和固定化菌（酶）等新技术，形成今日的生物技术。生物技术是应用生物科学的理论、方法以和技术，按照人们设计的蓝图，改良和加工生物或用生物及其制备物作为加工原料，提供所需的生物制品，为人类服务的综合性科学技术。它涉及许多基础学科和工程学科，也是上述新技术的具体开发和应用。它不仅是一门综合性的技术。它涉及许多基础学科和工程学科，也是述新技术的具体开发和应用。它不仅反映着当代生物科学中最新科研成果，也不断赋工程科学以新的生命。它不仅是一门综合性的技术，也是一个知识密集的新产业，应用领域很宽，包括农业、食品工业、化工、药品制造、发酵工业、能源和社会服务等。,生物技术的内容大致分为两个方面：直接型生物细胞的利用技术和模拟型生物细胞的利用技术。以现代前沿技术来说，一般认为有四方面：即基因操作技术；细胞融合技术；细胞大量培养技术和生物反应器技术。可概括为基因工程，细胞工程，发酵工程和酶工程，与生化工程关系也很密切，也可并入，构成五大工程。生物技术的应用，已经取得相当大的成果，特别是在医药方面，已经开发展出了不少的新药，见表1。生物技术中，当前人们最感兴趣的是基因工程和细胞工程，它们是生物技术的主导领域，也是热点。形成独特产业的发酵工程和酶工程等也是生物技术中的重要组成部分。这几方面的内容是相互联系和互相促进的。基因工程和细胞工程常常是发酵工程和酶工程的基础，所以现代发酵工程包括整个生物工艺过程。作为发酵工业来说，除了传统的利用天然微生物发酵生产初级代谢产物和次级代谢产物外，由于生物技术的出现，发酵工业所涉及的范围得到扩大，生产技术得到改造，因而发酵生产能力和控制水平大为提高。,DNA重组技术获得的部分药品药物名称适应性胰岛素糖尿病生长激素侏儒症血清白蛋白外科休克烧伤蛋白因子血友病尿激酶心脏病发作、中风组织血纤维蛋白溶酶原活化剂血栓症干扰素癌症病毒感染淋巴激活素癌症自动免疫病感染白细胞介素是一种淋巴因子具多种功能肿瘤坏死因子(TNF)抗李斯特菌致死攻击、血管生成等心钠素（ANP）具有强利尿、扩张血管和降压作用等,像基因工程所获得的工程菌一样，许多哺乳动物的基因克隆在大肠杆菌等宿主中能够得到表达等等。使用小鼠体内法生产单克隆抗体，产品常含有毒性杂质和不易大量生产等缺点，目前也采用同微生物发酵一样的发酵罐的生物反应器来进行催化反应，获得所需的产物。酶工程中的固定化细胞（或酶）也可用类似发酵罐的生物反应器来进行催化反应，获得所需的产物。这些事实都说明它们之间的密切关系，也说明发本酵（或类似发酵）技术在制得产品中的地位。另外，计算机技术用于发酵控制也已趋于广泛。,一.工程菌的发酵1.工程菌的来源和应用基因工程是在生物体外对DNA分子进行重新组合，然后克隆到适合的宿生细胞，进行增殖和表达的遗传操作。所得重组体菌株即是工程菌。获得它的基本过程如图。基因工程的关键问题在于目的基因在宿主细胞中能否表达，即DNA在宿主细胞中能否转录和翻译，表达形成的产物在胞内不被分解，并能分泌到胞外。而基因表达过程是多层次的，因此影响基因表达的因素也是多方面的。,比较理想的、能够成为工业使用的基因工程菌应具备下列条件：1）发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，当然也是分泌型菌株；2）菌株能利用常用的碳源（如糖蜜、淀粉等），并可进行连续培养；3）菌株是不致病的，也不产生内毒素；4）发酵所产生的热量和需氧量都较低，发酵温度也适当；5）代谢控制容易进行；6）能进行适当的重组DNA，并且稳定，重组的DNA不易丢失。基因工程技术已趋于成熟，所得工程菌已得到应用，并已开发出不少产品投入市场如胰岛素、干扰素、生长激素和乙型肝炎疫苗等，还有几十种可能成为药物的产品正在开发中。在氨基酸工程菌组建上，也获得了成功，如高产的苏氨酸工程菌。在抗生素生物合成上，在分析和分离生物合成基因结构特点和表达调节的基础上，已成功地把基础因工程技术用于提高抗生素的产量上，如将头孢菌素生物合成的限制性扩环酶基因克隆到产生菌中，使头孢菌素C的产量提高了15%。我国在基因工程研究开发上，也取得了不少成就：已获得青霉素酰化酶基因工程菌，并中试成功，达195u/ml水平；利用工程菌也中试成功人a型干扰素等。,2、工程菌的培养（1）基因重组细胞的种类宿主细胞可以采用原核的大肠杆菌和枯草杆菌、真核细胞的酵母菌和哺乳动物细胞等。所以，生产基因重组产物就有不同的菌体或细胞。但当前生产上使用多的仍以大肠杆菌为主，因为在大肠杆菌中，多种哺乳动物和其他微生物的蛋白基因能够得到高效表达，产物能得到过量生产、产量可达大肠杆菌菌体总蛋白的50%（如人胰岛素）。这就为生产多种蛋白药物（如白细胞介素-2，人生长激素、干扰素等），提供了基础。但大肠杆菌不具备分泌系统，产生的产物以包含体（inclusionbody）形式存在于细胞质中，这给分离纯化造成了困难。因此，人们才研究能分泌蛋白的酵母系统和枯草杆菌系统（2）工程菌的培养工程菌的培养与普通微生物的好气培养无大差异，但有其特点。从培养工程来看，其主要因素有：营养源（碳源、氮源、氨基酸、溶解氧等）浓度的控制和有毒代谢产物的排除。在生物学上还应考虑：质粒的稳定性、质粒拷贝数的控制、转录效率的提高与控制、翻译效率的提高以及菌体向外分泌产物等因素。因此，工程菌的开发研究仍须重视培养技术，才能获得大量产物。,培养装置在进行以工业化为目的DNA重组实验，以及为生产异种基因产物而培养重组菌，应采用简便易行的培养系统。以大肠杆菌为主的宿生的培养多使用一般的通气搅拌罐。基因重组动物细胞的培养，实际上与过去动物细胞培养一样，所用的培养装置和措施与微生物培养并不相同。工程菌的基础实验仍使用常规的培养皿、试管、玻璃瓶等培养器。实验者应按实验准则的要求，谨慎进行操作，应使用移液抢处理重组体，操作应在安全柜（或室）中进行，目前已有规定的细则，以防止工程菌外漏和扩散。中间试验或大量提纯产物时，必须进行重复性好的稳定培养。要取得大量培养液或培养数据，要用带各种传感器的培养罐，以测定和控制pH值、溶解氧、底物浓度等参数。许多培养数据还可通过联机取得，或经自动分析记录下来，这样自动化系统能有效地减少实险操作者与基因重组体的接触机会。密闭型通气搅拌培养罐按采用高压蒸气灭菌。工程菌的培养装置既要防止外界微生物侵入罐内，污染杂菌，又必须不使重组体外漏。这是与沿用的通气搅拌式培养罐的区别所在。,培养基和高密度发酵微生物生产的蛋白质类产物，常是一种粗品，因此可以使用各种复杂培养基。但工程菌的产物多属于人或畜体内蛋白质，需要有很高的纯度，否则，不能在体内使用，所以，发酵生产须要有严格的要求。工程菌发酵有两条基本要求，首先是要使菌体生长良好，获得高浓度菌体（即高密度发酵），这样才能得到最多的产物；其次是发酵所用培养基的成分必须保持尽可能的简单，以便分离产物。据报道，培养大肠杆菌最高可得干重菌体125g/L，酿酒酵母可得145g/L。枯草杆菌大概可得干菌体20-40g/L。这些数值还不是工程菌培养的结果。我国对人a1型干扰素工程菌（大肠杆菌K12系BMH71-18株），进行高密度发酵，得到100.25g/L的菌体。这与培养非工程菌的菌量相接近。大肠杆菌、其他细菌和酵母菌在合成培养中都能良好地生长。工程菌发酵所使用的培养基也是合成培养基，包括葡萄糖、铵盐和无机盐等。其组成必须满足获得高浓度菌体的要求，发酵中间过程还必须补加碳源和氮源，也用氨水来调节控制发酵pH。其他的培养条件，如搅拌转速（与剪切力有关）、溶解氧、培养温度、培养pH、接种龄和接种量等条件，对菌体生长和产物产量都有影响。,从安全性来考虑菌体营养源的问题，培养工程菌的外界条件至少要遵守物理密封（P1P4）方法中的P1级规定。从生物安全性来考虑，常采用维生素或氨基酸营养缺陷型的工程菌。维生素缺陷型仅需极少量维生素，过量也无影响。在培养氨基酸缺陷型菌株达到高浓度菌体之前，培养一开始就要加入必需量的氨基酸，这样就会因过量氨基酸而抑制菌的生长。为此，可采用调节pH的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法，使整个培养期间葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，培养大肠杆菌C600菌株时获得60g/L干菌体。菌体对葡萄糖及氨基酸的收得率因培养条件不同而不同。以葡萄糖、苏氨酸、亮氨酸、组氨酸、色氨酸为营养源时，平均每克所得菌体量（干重）分别为0.3、2.5、15、40、40g。以获得1g菌体所需要营养源的价格进行比较，苏氨酸的费用最高，因此要避免用苏氨酸缺陷型作基因重组用的宿主菌，最好使用维生素缺陷型菌株。菌株和质粒的稳定性在工业发酵运行中，菌株必须具有很好的稳定性。对工程菌发酵来说，细胞中的质粒稳定性和质粒内在稳定性同样重要。质粒保存率高，相应地就会得到高浓度的产物。在进行摇瓶试验时，因菌体浓度低，无须考虑质粒稳定性的问题，但在研究工业化生产时，这是一个极为重要的课题。在含有抗生素抗性标记相应的培养基中进行培养，保持选择压力。,有关质粒保持和稳定性的遗传和环境的影响因素，研究的比较多。有人报道，大肠杆菌RRI中的pBR322质粒可以维持约60代。以这样稳定的细胞，1个细胞可以分裂足够多的次数，产生细胞密度为10g/L的培养液达11500L。在24（或少于24）小时，就能产生出象胰岛素、生长激素、干扰素等蛋白质。因此就不需要利用抗生素耐药性来保持稳定性，而且另外的方法，如调节温度，使得在相当短的时间内，得到很高水平的基因表达。3.安全问题(1)重组DNA实验准则1974年，提出了DNA重组实验具有潜在生物危险的问题。后来就制订了在实验室中构建工程菌及使用工程菌的实验应遵循的准则，以保证实验的安全和推动重组DNA的研究。这些准则是采用物理密封（P1P4）和生物学密封（B1B2）两种方法。物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项所组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。,企业中进行重组菌培养的设备标准有LS-1和LS-2。LS-2相当严格，工业生产应在LS-1的设备标准下培养。LS-1标准要点是：使用防止重组体外漏、能在密闭状态下进行内部灭菌和培养装置；培养装置的排气由除菌器排出；使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。设计用于基因重组菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂菌侵入，还要防止重组菌的外漏。此外，培养后的菌体分离、破碎等处理也必须在安全柜内进行，或是采用密闭型的设备。(2)防止基因重组菌外漏的措施在普通通气搅拌培养罐培养菌体时，可能发生外漏的部分和操作有：A排气；b机械密封；c取样；d培养后的灭菌；e接种；f放罐。这些部分和操作均应采取一些措施，以防止重组菌外漏。有关负压洁净室级别分类技术标准和P1P4级实验室适用工况范围见下页表。,负压洁净室级别分类技术标准,级别工作特点,P11.通常用微生物实验室若干低等真核生物及原生动物、磁菌体2.可用嘴操作吸管3.对外人进入不限制4.可在开放性实验台上进行实验P21.禁止外人进入实验区域无脊椎动物及植物、变温脊椎动物2.可能发生气溶胶的实验在II级生物学安全柜的生殖细胞和胚胎3.禁止用嘴操作吸管4.室内设高压消互毒柜,对废弃物先灭菌再排放P31由双重门，气闸和外部隔离开实验区域变温脊椎动物，无脊椎动物的病毒2非本区人员禁止入内植物病毒灵长类以外的哺乳类及鸟类3平时送外部空气送入室内，室内排气经HEPA滤后排放室外4在II级生物学安全柜内进行实验5实验人员工作服为室内专用，先灭菌后，再拿到外面去洗涤P41采用独立建筑物由隔离区与外部隔断2根据相应隔离等级，保持室内负压3在密闭型生物学安全柜（GBLII级）内做实验4非本区人员禁止入内5取出器材，废弃物先经双门高压消毒柜灭菌消毒后，再取出，排出废液也要先灭菌后再排放6实验入口处设置国际生物学危险标志灵长类的癌及致癌性研究,如何提高高产菌的稳定性？（1）首先在菌种选育中应把菌株产量分布中的稳度作为评价菌株的条件之一。不仅以产量高低为基准；（2）菌株选育中避免使用含有多核的包子和菌丝片断；（3）用单倍化试剂处理高产菌株，有提高菌株稳定性的作用；（4）在培养基中加入某些金属离子可增加菌株的稳定性；（5）利用营养缺陷型和原养型在生理和抗性上的不同，在发酵培养基中加入抗生素也会有防止回复突变发生的效果；（6）在生产过程中应尽力减少菌种传代次数，这是发酵工业中普遍遵循的原则；（7）杂菌污染、发酵条件改变都能引起发酵生产产量波动，应注意区分原因。,提高次级代谢产物产量的方法？答：1）补加前体类似物；2）加入诱导物；3）防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生；4）防止氮代谢阻遏的发生；5）筛选耐前体或前体类似物的突变株；6）筛选抗抗生素突变株；7）筛选营养缺陷型的回复突变株；8）抗毒性突变株的选育。,试述提高初级代谢产物产量的方法？1)使用诱导物；2)除去诱导物-选育组成型产生菌；3)降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生；4)解除分解代谢阻遏-筛选抗分解代谢阻遏突变株；5)解除反馈抑制-筛选抗反馈抑制突变株；6)防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株；7)改变细胞膜的通透性；8)筛选抗生素抗性突变株；9)选育条件抗性突变株；10)调节生长速率；11)加入酶的竞争抑制剂。,二.动植物细胞的组织培养1.动物细胞培养动物细胞培养又称组织培养，是生物技术的重要组成部分。它与植物细胞、微生物细胞培养不同，是将来自动物某些器官或组织的细胞，在模拟体内生理条件下进行体外培养，使之存活和生长。早期的动物细胞培养，实际上是以组织片来进行培养的，后来改进为单细胞状态培养，并作为生产疫苗等物质的培养手段。1975年后，建立了以大量制备有用的细胞成分为目的的培养设施而进入新阶段。它不仅用于生产各类疫苗，而且随着动物细胞可以作为外来DNA的受体细胞的DNA重组技术的成功而得到发展，已可用来生产人生长激素、人胰岛素和干扰素。培养能产生生长激素的基因工程细胞猴肾细胞，最高表达量，以1107个细胞计，每日可获得近1mg的产物。使用该法生产的产物有5大类：a.病毒疫苗（如脊髓灰质炎、狂犬病、乙型肝炎等的疫苗）；b.干扰素；c.激素；d.免疫剂；e.人体活性蛋白（如胰岛素、血纤维蛋白溶酶原等），其中病毒疫苗生产已得到广泛应用。,(1)动物细胞的性质动物组织经物理切碎、切片，或者经化学法或酶法处理所得的细胞，一般经约50代分裂繁殖，便退化死亡。在培养期内，染色体数目和二倍体细胞特性仍保持正常。这类细胞被称为初代培养细胞。细胞在反复分裂的过程中，有时出现繁殖能力突然培强、几乎无限制繁殖的细胞。其形态、病毒敏感性、抗原性、染色体构成等都发生了变化，完全失去原细胞的特性。我们把这一类通常所说的癌细胞称之为确立细胞株或株化细胞。来源于小鼠的L细胞和来源于人子宫颈癌的Hela细胞就是有名的确立细胞株。绝大部分初代培养细胞只能附着面层着在容器壁上进行繁殖，形成单层状细胞层，因此称为贴壁附着细胞或附着性细胞。用胰蛋白酶处理这个细胞层，又可分散成单细胞，如果继续培养又可形成单细胞层。我们把这种操作称为移植继代培养。但这类细胞与确立细胞株不一样，不能无限繁殖，人胚胎组织的细胞经过50次分裂便停止繁殖，为区别起见，把这类细胞称为细胞株。,这类细胞在繁殖初期也有形态变化，经过几代反复分裂繁殖后，只有一种能继续繁殖的叫做成纤维细胞，其他形状的细胞就消失了。通常，成纤维细胞在50代内染色体是正常的。成纤维细胞的繁殖过程是，开始于初代培养细胞期，随着世代的增加进入对数繁殖期，大约经过3050代的繁殖，生长速度就变缓慢，进入衰减期，这时细胞分开明繁殖就完全停止，继而死亡。在此繁殖过程中可能出现有少部分细胞发生变异的确立细胞株。成纤维细胞在衰减期之前，大部分不具癌化性，仍留初代培养细胞的性质，因此非常安全可靠。如果从中采集繁殖1020代的细胞作种细胞，冷冻保存在-800C，供作生产疫苗、尿激酶、干扰素等的组织培养的种细胞是可行的。确立细胞株一般都显示非常稳定的繁殖特性，可以无限增殖，在大多数情况下，可用于大量悬浮培养。然而，它具有癌化性质，用来生产疫苗之类物质是带有一定的危险性。可是，近代分离纯化支术的进步，有可能除去夹杂有害物质。这样用确立细胞株生产有用物质也是完全可能的。例如：1982年用来自淋巴瘤的确立细胞株淋巴芽球细胞作种细胞进行悬浮培养，生产出用于临床的人干扰素。,（2）培养条件动物细胞的培养条件和微生物培养相似，除要保证无杂菌外，还需要适当的营养、pH、温度、溶解氧、罐压、搅拌转速、渗透压等。细胞培养最适温度为37+0.5，偏离此温度，生长和代谢就受到影响，甚至死亡。实验证明，细胞对低温的耐受性比对高温强。大多数生物体液的pH都接近中性，细胞生存的pH在6.87.6之间，最适pH为7.27.4间，当pH低于6.0或高于7.6时，生长就受到影响，甚至死亡。但多数类型的细胞对偏酸性的耐受性较强，在仿碱性条件下则会很快死亡。作为代谢产物的CO2，除保证体内的代谢活动外，还有调节pH的作用。大多数培养基的pH就是利用CO2（NaHCO3缓冲系液）和细胞代谢产物（特别是乳酸）的组合来控NaHCO3控系统就是血中自然缓冲剂。在培养箱中，可根据需要持续地提供一定比例的CO2气体。在培养罐中，可增加NaHCO3的用量，调节CO2浓度来控制培养液的pH，以保持比较稳定的pH范围。溶解氧的控制，通常都是采用控制通气量、搅拌转速和空气中的氧浓度等因素来实现，但对脆弱的动物细胞和易产生泡沫的含血清培养基，只有在维持适宜的通气量和缓慢的搅拌的基础上，通过改变空气中的氧浓度来进行。现在有一种控制溶氧的办法是将硅氧管浸的培养液中，通过硅氧膜从管内供氧。用这种办法可增加供氧浓度，也可增加气液接触面积。适当的渗透压可通过调节培养液中的盐和葡萄糖浓度来维持。只有满足这些基本条件，细胞才能在体外正常存活和生长。在实际培养中，还应根据不同细胞体外培养的难易程度采取不同的具体措施。,（3）培养基动物细胞培养基的组成是一个极为重要的问题。它必须要有足够的糖、脂肪、蛋白质和核酸等代谢所需要的各种成分，包括十几种必需氨基酸及其他非必需氨基酸、维生素、糖和无机盐等。氨基酸只利用L-型；碳源以葡萄糖为最常用，半乳糖也可以，但不能利用双糖；维生素、无机盐是由血清提供或单独添加。由于培养基成分的来源不同，有下列几种培养基。合成培养基和血清培养基人们对确立细胞株的营养要求进行了广泛的研究，出现了许多化学合成培养基，并在市场上出售。其中最有名的是伊格尔（Eagle）的最低基本培养基，简称MEM，见下表。它是由13种必需氨基酸、8种维生素、葡萄糖和无机盐所组成。对于细胞繁殖来说，尚须加入5%-10%的动物血清（如小牛血清）。但从经济成本或血清供给来看，使用这种培养基都是不现实的。由于所用血清来源批次不同和含有较多蛋白质，培养结果的重复性往往较差，细胞产物还混有异种蛋白，给分离精制带来很大的困难。无血清培养基近年来对无血清培养基进行了深入研究，已有商品出售。通常所说的无血清培养基有：基本合成培养基、基本合成培养基加生长因子（功能因子）和基本合成培养基加组织抽提液三种。,伊格尔的最低基本培养基（MEM）组成,注：L-谷氨酰胺（过滤灭菌）0.292g/L10%碳酸氢钠水溶液（在密闭状态下高压灭菌）适量,前两种成分明确，又称已知成分培养基，第三种成分较复杂，含量不确定。后2种中加有生长繁殖所需的生长因子或组织抽提物，又称为代血清或无血清培养基。无血清培养基应考虑的生长因子有上皮细胞生长因子、T-细胞生长因子、氢化可的松、胰岛素、硒、铁传递蛋白等十八种。该培养基的成分和配比是可以人工控制的，因而具有极强的适应性，可使人工细胞、变异细胞在最适生长条件下生长繁殖，产生有用的物质，也可简化产物的分离和精制。这些都是添加生长因子无血清培养基的优点。（4）动物细胞大量培养技术培养的动物细胞可分为悬浮型和贴附型两大类。悬浮型细胞呈圆形，生长时呈悬浮状态，通常是某些癌细胞和血液细胞。大多数培养的细胞是贴附型，培养时贴附在支持物上。由于细胞类型不同，故有下列几种培养技术：a悬浮培养；b贴壁附着培养；c罐培养技术,悬浮培养这种培养技术与培养微生物相似，基本上利用常用的发酵罐装置，控制条件（如氧化还原电位、细胞类密度等）有所不同。曾用一定规模的发酵罐培养淋巴芽球细胞来生产过a-干扰素。在特殊的连续培养装置中，使用无血清培养基实现了该细胞的高密度发酵。因此，这种方法可进行大规模细胞培养来生产有用物质。贴壁附着培养贴附型细胞的基本特性就是必须附着培养容器壁的介质上才能生长繁殖，因此这类细胞就要采用贴壁附着培养。为了增大附着面积，过去常用扁瓶简单装置来进行单层静置培养。由于生物技术的迫切需要，现已开发出各种形式的培养装置，如旋转瓶和多段式托盘培养装置，已用于B-干扰素的生产。但利用这些装置仍是手工操作，生产量不大，所以又研制出微载体培养。微载体培养所用的微载体是交联葡萄糖经二乙氨基乙基化后所得的离子交换树脂，其电荷密度规定在适于细胞培养的范围内。将这种载体悬浮在培养液中，细胞便附着在上面进行单层状增殖，密布在整个微载体的球面上。该法虽是贴附培养,但仍可用上述的发酵罐进行,所以单位培养面积所占的容积比上述装置要小的多.如葡聚糖的Cytodewx1微载体,在干燥状态下,它的大小为6087m,在培养液中可膨胀成160230m,每克微粒的表面积约为0.6m2,相于7个标准旋瓶(285mm110mm)的表面积。国外已在100L的规模上大量生产B-干扰素、口蹄疫疫苗。还用近吨级的发酵罐，实现了微载体培养动物细胞的新工艺。所以，该法具有许多优点，是大量培养动物细胞很有前途的方法。,罐培养的技术要点由于动物细胞比较脆弱、营养和培养条件要求比较严格等，所以它的培养具有独特的性质。使用发酵罐大量培养动物细胞，应掌握下列技术要点：a.培养装置和培养系统基本上与微生物相似，但有些特殊考虑。突出的有以下几点：1-搅拌桨叶的形状和搅拌转速要有特殊设计。动物细胞膜薄而胞弱，受不了强烈机械搅拌。搅拌桨叶以3片叶轮为好，也可用塑料纤维制的风帆式桨叶。转速要慢，一般是820r/min。悬浮培养可加档板，微载体培养以不装为好；2-培养系统必须保持长期无菌状态。因动物细胞生长缓慢，抗杂菌污染措施。培养初期可加少量抗生素（如青霉素、链霉素等），但细脆性工成致密单层时应避免加入，因抗生素可使细胞从微载体表面脱落下来。还有其他一些措施；3-培养罐、配管的材质必须要对培养的细胞无毒害作用，通常都采用含钛的不锈钢。所用橡皮垫圈或橡胶衬垫必须事先经过热水浸泡，否则，橡胶中的培塑剂或添加物就会因蒸汽加热而溶出，对细胞产生毒害作用而影响细胞生长。b.培养条件的控制动物细胞培养可以采用分批、流加、半连续和连续等培养法。微载体培养只能用分批培养法。分批培养中，细胞生长因子要逐渐被消耗掉，并产生乳酸类的代谢产物。这类产物对细胞生长有抑制作用，因此，在培养过程中要多次更换培养基，保留微载体，弃去上清液，补充新鲜培养液。其他的环境条件，如温度、DO、pH、罐压、转速等也要控制。由于动物细胞大量培养在医药生产上有广阔的前途，所以为增加细胞密度最近已开发出一批新的培养技术。如灌流培养就是其中一种高密度培养技术，所能获得的细胞密度比常用方法高10100倍以上，由106个/ml上升到107108个/ml（而动物组织的细胞密度过大约是109个/ml），因而生产能力得到明显提高。,2.植物组织细胞培养切取植物的叶、茎、根等组织的一部分，将其表面进行杀菌后，放入具有营养成分的培养基中进行培养，这种培养技术称为组织培养，或称之为愈伤组织培养。有时也把在液体培养基中进行振荡培养或搅拌培养称为“细胞培养”。现在植物组织培养不仅用来繁殖种苗，而且也用于生产生物药物等。植物的产物有20类50多种，如医药中的吗啡、麻黄等生物碱，人参皂苷等皂苷，蒽醌等醌类，维生素E等酚类以及色素、香料和食品等产物。经过近30多年努力，已建立起大规模生产植物产物的技术基础。这种细胞培养方法具有以下优点：可以在人为控制条件下进行物质生产，克服人工载培的不足；不受季节气候的影响，不需占用大量耕地；可以排除病虫害的侵扰；可以进行特定的生物转化，克服化学全成的缺点。因此，该技术得到了迅速发展，已成为当代生物技术的一个重要组成部分，也已发展成为一门新兴的科研产业体系。,（1）植物细胞的结构和生理特性植物细胞直径在20150m之间，比细菌大30100倍，比许多霉菌还大310倍。在培养过程中，植物细胞形态有明显的变化，形状和大小都不相同，体积大约要膨大105倍，其细胞容积可达培养液的40%50%培养的粘度也随之显著上升，烟草细胞对数生长期的粘度约为培养初期的30倍。植物细胞在培养过程中，初期是比较大的游离细胞，随后便分裂成一个一个的较小细胞，但末能分开，有趋向形成细胞数目不等的细胞块或聚集物，其数目可达200个，直径达2mm，但植物细胞有一定的粘性，很易“粘结”，聚集物的大小还随细胞种类而不同。利用细胞壁降解酶和物理方法，可获得游离细胞悬浮液，但又可能恢复成块状。植物细胞的生理代谢活性确比微生物小的多，其繁殖增代时间约为25100小时，而细菌仅为20分钟。呼吸率也低，约为1umolO2/（h106细胞），所以培养的需氧量和氧传递效率的Kla值的要求就低的多，对烟草细胞来说，Kla在10/h以上，即可保证细胞有足够的溶氧进行生长。（2）培养基和培养条件深层液体培养植物细胞，所用培养基的组成是相当的重要的，其成分多半是采用适合细胞生长的培养基，包括碳源（一般是蔗糖或葡萄糖）、氮源、无机盐、各种生长因子（如维生素）和植物生长调节剂。1963年研究成功的用于烟草细胞培养的“RM-1962”完全合成培养基。不只是适用于烟草细草细胞，根据培养的不同目的，调整部分成分后，就可用于其他愈伤组织或植物细胞的悬浮培养。植物细胞培养的目的，有的是以生产有用的物质（包括初级和次级代谢产物）为目的，有的是以种苗生产为目的。,“RM-1962”培养基，mg/L,NH4NO31650KNO31900KH2PO4170H3BO36.2MnSO422.3ZnSO44H2O8.6KI0.83Na2MoO42H2O0.25盐酸吡哆醇0.5盐酸硫胺素0.1甘氨酸2.1吲哚醋酸130,CuSO45H2O0.025CoCl26H2O0.025CaCl22H2O440MgSO47H2O370FeSO47H2O27.8Na2-EDTA37.3肌醇100烟酸0.5激动素00.4-10蔗糖30g/L琼脂10g/L,成分浓度成分浓度,植物细胞培养大都是在缓慢振荡或缓慢搅拌条件下进行的。用摇瓶培养烟草细胞时，振荡频率都是110r/min，偏心距为3.5cm。在用小发酵罐培养时，通气量为0.5v/(vmin)，搅拌速度为50100r/min。培养温度是由植物细胞的特定条件和培养目的来确定的。一般是在2535。C之间，如西洋参细胞培养，愈伤组织为0.5。C。当然，其他植物细胞的培养条件还随植物种类和细胞状态不同而异。,（3）培养设备和培养方法用于植物细胞层培养的装置，无论是小规模实验，还是大规模培养，基本上都和微生物培养装置一样。但由于植物细胞有上述的结构和培养特性，培养装置也有特殊定要求，如培养液混合要求良好，但剪切力却不能大，适当的KLa以及严格的无菌条件等。曾以产生蒽醌的海巴戟细胞株为试验细胞，采用合成培养基，与摇瓶培养装置、普通桨式搅拌通气罐、带卡普兰桨叶的气流等气升式罐和带气流管的气升式培养罐等5种装置的培养效果进行比较，结果以最后一种带气流管的气升式培养罐的效果为最佳。该装置的径高比为0.44,通气量为0.5v/(vmin),罐中混合状态良好,细胞生长和蒽醌的产量都比较理想.植物细胞悬液培养的方法虽然很多,概括起来主要分批培养法、半连续培养法和连续培养法，a.分批培养操作简单,应用广泛,实验室和工业生产规模均可应用.其生长过程与微生物一样,但生长速度比微生物缓慢,增代时间较长,烟草细胞的0.044/h(小于酵母的1/10),平均增代时间td为15.8小时整个过程须建立严格无菌培养技术.培养过程一般采用二段培养,即微生物的二级发酵,第一级为种子罐,用适合细胞生长培养基来繁殖细胞；第二级为发酵培养，用成分不同的培养基以生产有用物质。b.半连续培养即在分批培养中，部分培养液和新鲜培养基进行交换的培养方法。该法与分批培养相比，细胞培殖量及有用物质的产率均较高。c.连续培养即连续补料连续排出培养液，以保持细胞生长环境恒定的培养方法。一般说来该法的细胞生产能力要比分批培养高。但是，由于植物细胞生长极为缓慢，培养时间长，要长时间维持培养系统的无菌状态，在技术要求上是相当苛刻的，所以现在有人将连续培养改进为双罐连续培养法，分别控制不同的营养成分，取得了比较好的结果。,（4）植物细胞大量培养的应用植物细胞培养技术主要用于种苗的生产和次级代谢产物的生产。前者属于植物繁殖问题，后者属于工业化生产植物产物的问题。这里只简单介绍后一方面。该技术的发展，使得植物细胞象微生物细胞一样，利用发酵罐来生产过去只能从植物提取的一系列产品。例如，药用植物的有效成分、香料、蛋白酶抑制剂等重要商品。其培养过程象微生物发酵一样，包括三个步骤：a.细胞株建立，包括愈伤组织的培养，愈伤组织经单细胞分离出的优良无性繁殖系，经摇瓶培养所得的游离细胞，供作种子；b.扩大培养，种子细胞经多次扩大繁殖后，供作发酵接种材料；c.大罐培养，发酵生产所要的植物产品。利用这种技术所得的次级代谢产物的含量比原植物株要高得多。例如，人参的冠瘿细胞、愈伤组织和再分化的根在琼脂培养基和液体培养基中培养几周，所得的粗皂苷的含量分别为21%、19.3%和27.4%，而天然根中的含量仅为4.1%。1968年人参细胞培养的工业化生产达到18m3的规模。紫草素和小蘖碱的生产也已达到实用化水平，其中作为高级染料和治疗药物的紫草素含量达55%65%，而天然紫草根的抽提液仅22%52%，药源还困难。因此这种培养技术得到蓬勃发展，已成为当代生物技术的一个重要组成部分植物细胞培养已显示出诱人的前景。,三.固定化细胞发酵1.概述酶工程是生物技术的一个组成部分，包括酶（或细胞）的固定化技术及其应用，酶常常是不稳定的，又不易重复使用，但固定化后的酶则显示出稳定性明显提高、可以重复（或连续）使用的优点。所以，出现了包括具催化功能的固定化酶和固定化细胞的“固定化生物催化剂”。由于固定化酶（或细胞）具有简化生产工序、降低成本、节约原材料和能源、提高产量和收率以及改善环境污染的能力，所以在各个领域中，已得到广泛的应用。,固定化技术与发酵技术的比较,在发酵工程中，使用固定化细胞代替游离细胞就像固定化酶代替游离酶一样，具有如下的优点：a.分批发酵可用固定化细胞进行连续反应来代替；b.可以利用高密度的固定化细胞集合体进行发酵，反应效率大大提高；c.可以人为地控制固定化细胞的生理状态，因为许多化谢产物（或酶）仅仅在细胞的静止期才能形成，所以有利于产物的形成。发酵液的体积也大大减小。由于上述优点，固定化细胞发酵已代替许多利用连续酶反应的常规工业操作，在某些领域中，已（或将）取代一些传统发酵技术，如已用于甾类激素转化、氨基酸生产和酒精生产等领域。固定化细胞与固定化酶相比，虽与反应系统有关，仍具有以下优点：a.固定化细胞可以免除固定化酶需要的酶的提取和精制步骤；b.固定化细胞系统对外界条件（如pH）变化的敏感性不强，故有利于控制反应；c.固定化细胞允许有高负荷的载体，而载有固定化酶的载体，由于蛋白-蛋白之间的相互作用，可使酶活下降；d.如果反应系统需要许多酶和辅因子再生。采用固定化细胞则是最好的选择。目前，已经形成了固定化细胞技术，并已转向重点研究固定化细胞的特性、反应器的选项择和应用。固定化细胞的种类，也从原来的微生物细胞扩大到动物细胞、植物细胞以及DNA重组技术和细胞融合技术所组建的细胞。,2.固定化细胞的特性细胞的固定化方法很多。但任何一种限制细胞自由流动的技术，都可用于制备固定化细胞。根据已有的资料，固定化细胞的制备方法大体可分为吸附法、包埋法、共价结合法、交联法、多孔物质包络法、超过滤法等几大类。其中以包埋法使用最为普遍，有使用聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸钙凝胶、卡拉胶、琼脂糖胶等的凝胶包埋法和用半通透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊的微胶囊法2种。至于采用哪种方法，还须根据不同细胞和反应类型来选择。但理想的固定化细胞的制备方法，应该具有如下特点：1）能够控制固定化细胞的大小和孔隙度；2）固定化所使用的原料应该便宜、易得，成本应尽量低；3）固定化方法简便、易行，过程应尽可能温和，尽量少损伤细胞；4）固定化细胞应具有稳定的网状结构，在所使用的pH和温度下，不会被破坏；5）在反应器内长时间运转过程中，固定化细胞应具有良好的机械稳定性和化学稳定性6）用于制备固定化细胞的载体，对细胞应该是惰性的，即不损伤细胞；7）固定化细胞应该使底物、产物和其他代谢产物能够自由扩散，因为产物和其他代谢产物常常能抑制细胞的没反应，更需要扩散出去；8）单位体积的固定化细胞应该拥有尽可能多的细胞，当使用固定化活细胞时，更有此需要。其中1、6、7、诸点对大规模的工业应用尤为重要。,固定化细胞的生理状态，即是否具有生活力，是一个最明显和最重要的生理特性。经过固定化后的细胞，可能有3种不同的生理状态：1）固定化后是死细胞，这种状态只适用于一种酶催化的反应；2）固定化后的细胞生活力不确定，这种状态通常用于一种酶或少数几种酶所催化的反应；3）固定化后是活细胞，这种状态适用于多酶反应，特别是需要辅酶的反应。对固定化活细胞而言，维持细胞适度生长和繁殖是非常重要的。但生长、繁殖不能过度，否则容易使细胞泄漏出来，增加扩散障碍，破坏固定细胞的载体或基质等。为了保持固定化细胞的良好生理状态，还必须采用各种不同的方法（如提高通气的压力、改用纯氧，或设法降低氧气传递阻力以及在凝胶内产生氧气等）供应足够的氧气。对于固定化活细胞进行需氧发酵和生产代谢产的，氧的供应尤为重要。选择适当的固定化方法和生物反应器也有助于达到这个目的。固定化细胞内的物质扩散速率，在各种不同的包埋有微生物细胞的凝胶内，都有下降现象。由于细胞内传质的阻力，所以固定化细胞的反应速率是随固定化的颗粒大小和细胞密度大小而变，其呼吸强度和生长速度是随细胞浓度增加而降低。代谢作用一般将会降低，但抗拒不良的外界环境条件的能力，通常要比游离细胞高一些。固定化细胞周围的理化微环境对其活力的发挥有很大的影响，现已利用各种不同的方法来研究理化环境对固定化细胞的影响，如用聚乙烯醇来降低固定化细胞内水的活度等。,3.固定化生物反应器固定化细胞系统的生产能力和工业应用的可行性，在很大程度上取决于反应器的选择。因此，人们越来越重视对生物反应器的研究。固定化细胞生物反应器，按其用途可为分三类：1）生物转化反应器，多用于死细胞或不再生长繁殖的细胞。通常不需要供给氧气，也不需要排出CO2；2）生物的生成与细胞的生长无关的生物反应器，这可能需要或不需要供给氧气，但必须供给维持细胞生理活动和合成产物所需要的营养物。这类反应器适用于处在生长状态的细胞，有利于细胞生长和产生次级代谢产物；3）生产初级代谢产物的反应器，这类反应器必须符合细胞生长的需要并供给充足的营养物，提供良好的通气条件，并排出生成的CO2，还须要控制细胞的浓度，以便在恒定的条件下进