河南科技大学微生物工程学课件第一章绪论第二章1节

微生物工程,主讲：何佳ejia,内容（248学时）,第一章绪论第二章菌种第三章灭菌与空气净化第四章发酵工艺的控制第五章微生物工程生产实例2个实验（第二周、第四周，李爱江老师）,第一章绪论,一、微生物工程的概念,微生物工程（Microbialengineering）是利用微生物的特定性状和功能，通过现代化工程技术，生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系；是将传统发酵与现代DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的现代发酵技术。,微生物工程是渗透有工程学的微生物学，是发酵技术工程化的发展。也叫发酵工程,生物工程,微生物工程,基因工程,细胞工程,酶工程,微生物工程是生物工程的重要组成和基础，是生物工程产业化的重要环节。它将微生物学、生物化学和化学工程的基本原理有机结合起来，广泛而深入地揭示了发酵过程的本质。,二、发酵方法的类别与流程,1、类别：根据对氧的需要区分：厌氧和有氧发酵根据培养基物理性状区分：液体和固体发酵根据从微生物生长特性区分：分批发酵和连续发酵,2、发酵的流程,空气,空气净化处理,保藏菌种,斜面活化,扩大培养,种子罐,主发酵,碳源、氮源、无机盐等营养物质,灭菌,产物分离纯化,成品,3，典型的发酵过程示意图,菌种筛选,摇瓶试验,发酵罐试验,4.工业发酵步骤和工艺流程,(1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中(4)将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物(5)将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水,三、微生物反应过程的特点,一）优点：（与化学工程相比）,1、生产过程通常在常温常压下进行，操作条件温和，不需考虑防爆问题，一种设备具有多种用途。,2、原料是以碳水化合物为主的粗原料。,3、生产过程是以生命体的自动调节方式进行的，因此多个反应就象一个反应一样，可在单一设备（发酵罐）中进行。,4、能容易地生产复杂的高分子化合物，如酶、光学活性体等。,5、能高度选择性地进行复杂化合物在特定部位反应，如氧化、还原、官能团导入等。,6、生产产品的生物体本身也是发酵产物，富含维生素、蛋白质、酶等有用物质；除特殊情况外，培养液一般不会对人和动物造成危害。,7、通过微生物菌种改良，能够利用原有设备使生产飞跃上升。,二）发酵过程中尚存在的问题：,1、底物不能完全转化成目的产物，副产物的产生不可避免，因而造成提取和精制困难，这是目前发酵行业下游操作落后的原因之一。,2、微生物反应是活细胞的反应，产物的获得除受环境因素影响外，也受细胞内因素的影响，且菌体易发生变异。,3、原料是农副产品，虽然价廉，但质量波动较大。,4、生产前准备工作量大，花费高，相对化学反应而言，反应器效率低。,5、通常底物浓度不能过高，且要在无杂菌污染情况下进行。,6、发酵废水常具有较高的BOD和COD，需处理后排放。,四、微生物工程发展简史,1、传统的微生物发酵技术天然发酵,几千年酒（古埃及公元前40003000年；龙山文化4200年）啤酒、黄酒、酱油、泡菜等,2、第一代微生物发酵技术纯培养技术,LouisPasteur微生物引起发酵；酒精发酵由酵母引起EduardBuchner酒化酶(zymase)RobertKoch发明了固体培养基；建立了纯培养技术人为控制发酵过程酒精、丙酮、丁醇、有机酸等（主要厌氧发酵；初级代谢产物）,3、第二代（近代）微生物发酵技术深层培养技术,出现于20世纪40年代，以抗生素的生产为标志青霉素的发现与大量需求表面培养法(surfaceculture)效价40U/mL，纯度20%，收率30%,深层培养技术（submergedfermentation)机械搅拌通气发酵链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素等抗生素工业的发展促进了其他发酵产品的出现，如氨基酸发酵工业好氧发酵，初级、次级代谢产物,4、第三代发酵技术微生物工程,（1972）DNA重组技术、原生质体融合技术等应用1982，第一个基因工程产品利用工程菌生产的人胰岛素问世现有许多种类的产品,红细胞生成素(治疗贫血)生长激素(促进生长)胰岛素(治疗糖尿病)干扰素(抗病毒、抗肿瘤),五、微生物工程的应用,食品加工：单细胞蛋白（酵母、真菌等）含醇饮料：葡萄酒、黄酒、白酒、啤酒、白兰地、威士忌发酵乳制品：奶酪、酸奶调味品：味精、肌苷酸、酱油、醋等,微生物技术最早开发应用的领域，至今产量和产值仍占微生物工程的首位,1、在食品工业的应用,（一）微生物工程应用领域,2、在医药卫生中的应用,抗生素：12000余种青霉素、金霉素、四环素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、螺旋霉素、头孢霉素等,氨基酸：可发酵生产的有谷、赖、丙、组、异亮、亮、苯丙、脯、苏、色、酪、缬、瓜、鸟氨酸（国内40亿元，占发酵业产值12%）,维生素：VB2、VB12、Vc、VA、VD等,生物制品：亚单位疫苗、重组疫苗、DNA疫苗等,酶抑制剂：-淀粉酶的抑制剂可治疗糖尿病胆固醇抑制剂可治疗高血压高血脂,3、在轻工业中的应用,糖酶：-淀粉酶、-淀粉酶、异淀粉酶、葡聚糖酶、葡萄糖异构酶、半乳糖酶、纤维素酶等,蛋白酶：碱性蛋白酶（洗涤剂、皮革鞣化、啤酒去浊）酸性蛋白酶（饮料、制蛋白水解物）中性蛋白酶（皮革脱毛、蚕丝脱胶、蛋白胨制备）,果胶酶：果汁果酒澄清、苎麻脱胶,脂肪酶：分解脂肪为脂肪酸和甘油凝乳酶：制干酪氨基酰化酶、甘露聚糖酶等,4、在化工能源中的应用,醇及溶剂：乙醇、甘油、异丙醇、丙酮、丁醇、丁二醇等有机酸：醋酸、丙酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、水杨酸等多糖：黄原胶、海藻糖等清洁能源：氢气、微生物燃料电池等,5、在农业中的应用,生物农药：杀虫剂（Bt、白僵菌、病毒、微孢子虫）防治植物病害（假单孢菌、木霉、庆丰霉素）,生物除草剂：利用杂草的病原微生物生物增产剂：根瘤菌、蓝细菌、钾细菌、磷细菌等,6、在环境保护中的作用,污水处理（厌气法、好气法）,7、在高技术领域中的应用,基因工程的各种工具酶等,二）微生物工程产品类型,1、微生物菌体的发酵,SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）生物防治制剂（如苏云金杆菌）,细胞的生长与产物的积累成平行关系，生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段,2、微生物酶发酵,各种酶制剂糖化酶、氨基酰化酶（DL氨基酸光学拆分）、蛋白酶、脂肪酶等,3、微生物代谢产物发酵,初级代谢产物：与菌体生长相伴随的产物，氨基酸、核苷酸、维生素、有机酸、溶剂菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累,次级代谢产物：与菌体生长不相伴随，以初级代谢产物为原料而合成抗生素、生物碱、毒素、胞外多糖等结构常较复杂对环境条件敏感,4、微生物的生物转化,利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链等。,转化的最终产物并不是微生物细胞利用营养物质经细胞代谢产生，而是微生物细胞的酶或酶系作用于底物的某一部位，进行特定部位的化学反应而形成。,反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性,甾族激素：分肾上腺皮质激素和性激素；重要的生理调节作用，在临床上广泛用于治疗过敏性皮炎、类风湿性关节炎、红班狼疮、支气管哮喘等甾体药物的工业生产主要是通过改造天然的甾体产物而获得的；可的松类抗炎激素之所以有卓越的抗炎活力，主因在甾体母核11位上导入一氧原子，最大的困难也正在此化学转化：步骤繁多、得率低、价格昂贵（Savett,576kg脱氧胆酸，30多步反应，938mg醋酸可的松）生物法：高效、收率高（1952年，Munrry等，黑根霉，仅1步就将孕酮11位上导入一个羟基，使从孕酮合成皮质酮只需3步，这样才使可的松问世）,如：甾体转化,六、微生物工程面临的挑战和发展趋向,一）面临的挑战,1、化学合成工业的竞争有机溶剂，如丙酮丁醇发酵法产品所占份额已很少当然也有多种原来通过化工合成的产品逐渐被发酵法所取代，如乳酸,2、农业生物工程的冲击转基因植物中表达生产抗体、药物、植酸酶（将饲料中的有机磷转变为动物可以利用的形式，减少粪便中的磷，降低饲养场地区的污染）等,二）国外发酵工业的发展趋势,1，生物转化（或生物合成）技术成为国外著名化学公司争夺的热点，并逐步从医药领域逐渐向化工领域转移2，生产有特殊功能、性能、用途或环境友好的化工新材料。,武汉大学曹军卫主编（4部分）科学出版社,姚汝华华南理工大学出版社2002,俞俊棠唐孝宣(上、下册)华东化工学院出版社1991,俞俊棠唐孝宣等(上、下册)化工工业出版社2003,第二章菌种,第一节发酵工业常用微生物第二节菌种来源第三节菌种选育第四节菌种保藏,第一节发酵工业常用的微生物,（一）细菌,1、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),分布广，常存在于枯草、土壤等，一般为腐生菌；在酱油、酱类和白酒制曲时，如果水分含量大，温度较高，就容易造成枯草杆菌迅速繁殖；不仅消耗原料蛋白质和淀粉，而且生成刺眼鼻的氨味，造成曲子发粘发臭，使制曲失败。能产生大量淀粉酶和蛋白酶AS1.393蛋白酶BF7658-淀粉酶,2、大肠杆菌(Escherichiacoli),可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等基因工程的很好材料,3、乳酸杆菌(Lactobacillussp.),革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧可生产乳酸干酪的成熟、乳脂的酸化和腌菜、泡菜制作,4、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyleum),芽孢卵形，中生或次端生，使芽孢囊膨大成梭状或鼓槌形专性厌氧发酵生产丙酮丁醇,5、肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides),G+、微需氧至兼性厌氧，生长需要缬氨酸和谷氨酸在蔗糖液中形成特征性葡聚糖黏液（2025C促使形成）可生产葡聚糖使糖汁变粘而无法加工，为糖厂有害菌,6、醋酸菌(Acetobacter),不形成芽孢，G，好气性分两群：1）只将乙醇氧化成醋酸2）将产生的醋酸继续氧化成CO2和水可生产醋酸,7、棒状杆菌(Corynebacterium),以葡萄糖为原料发酵产生酸，是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌生产谷氨酸等如北京棒杆菌AS1.299、钝齿棒杆菌AS1.542,8、短杆菌(Brevibacterium),氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种,9、黄单胞菌(Xanthomonas),细胞直杆状，G，无芽孢，极生鞭毛在含蔗糖的琼脂平板上形成圆形、边缘整齐、粘稠光滑的黄色菌落；液体培养形成黄色粘稠的胶状物荚膜多糖，其黄色为一种水溶性色素野油菜黄单胞菌(X.campestris)可以淀粉生产黄原胶(Xanthangum),10、假单胞菌(Pseudomonas),能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡萄糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转化；有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。,（二）放线菌,因其菌落呈放射状而得名属原核微生物类群，在自然界中分布很广，尤其在有机质丰富的微碱性土壤中较多。大多腐生，少数寄生。产生多种抗生素（12000余种，60%左右来自放线菌），经济价值大,1、链霉菌属(Streptomyces),灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)生产链霉素,金霉素链霉菌(Streptomycesaureofaciens)在PDA培养基上生长时，基内菌丝产生金黄色色素生产金霉素,红霉素链霉菌(Streptomyceserythreus)产红霉素,龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)菌落灰白色，表面后期有皱折，呈龟裂状生产土霉素,2、小单胞菌属(Micromonospora),与一般放线菌不同，菌丝体长入培养基内，不形成气生菌丝，而在基内菌丝体上长出孢子梗，其顶端生一个球形、椭圆形孢子。菌落致密，与培养基紧密结合在一起，表面凸起，多崎岖，疣状；菌落常为橙黄色、红色、深褐色、黑色和兰色。多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌（M.echinospora）产庆大霉素,3、游动放线菌属（Actinoplanes）,一般不形成气生菌丝，孢囊在基内菌丝上形成，孢囊孢子在孢囊内盘卷或呈直线排列；孢子球形，有时端生1-40根鞭毛，能运动。济南游动放线菌(Actinoplanestsinanesis)产创新霉素(creatmycin;1964),4、诺卡氏菌属(Norcadia),一般无气丝，基丝培养十几小时形成横隔，并断裂成杆状或球状孢子。菌落较小，边缘多呈树根毛状。生产利福霉素、蚊霉素等,5、孢囊链霉菌属(Streptosporangium),孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢囊孢子，孢囊孢子无鞭毛产多霉素、创新霉素,（三）酵母菌,单细胞真核，主分布于含糖质较多的偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上，以及果园土壤中。,1、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),根据长与宽的比例，分三组：第一组长宽比为12细胞多为圆形、卵圆形；主要供生产啤酒、白酒和酒精及面包第二组长宽比为2多供生产葡萄酒、果酒用第三组长宽比大于2耐高渗透压，供发酵甘蔗糖蜜生产酒精用,2、葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum),与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵棉子糖和蜜二糖葡萄汁酵母常用于啤酒酿造的底层发酵，也可食用、药用或作饲料。,3、汉逊酵母(Hansenula),此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香味，可用于酿酒和食品工业。但由于它能利用酒精作碳源，又能在饮料表面产生干皱的菌膜，所以又是酒精生产的有害菌。,4、球拟酵母(Toruiopsis),此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。,5、假丝酵母(Candida),能形成假丝，液体培养时能形成浮膜可生产SCP、甘油、脂肪酶,6、红酵母(Rhodotorula),有明显的红色或黄色色素，很多种因生荚膜而形成粘质状菌落可由菌体提取大量脂肪、-胡萝卜素,7、棉病针孢酵母(Nematsporagossypii),又名棉病囊霉，能危害许多重要的经济作物，如棉花、柑橘、番茄等该菌具有大量合成核黄素的能力，是核黄素生产的重要菌种,9、毕赤氏酵母(Pichia),能利用石油或农副产品及工业废料产生菌体蛋白，有些菌株能生产麦角固醇、苹果酸、磷酸甘露聚糖近年来其在基因工程中的作用日益得到重视,（四）霉菌,1、根霉(Rhizopus),米根霉(Rhizopusoryzae)淀粉酶活力极强，多作糖化酶使用；又由于具有较强的蛋白质分解能力，也可用于制造腐乳。,华根霉(Rhizopuschinentis)是酿酒所必须的重要霉菌，也是酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌种。,2、毛霉(Mucor),鲁氏毛霉(Mucorrouxianus)从我国小曲中分离出来；能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，常用来制作腐乳,总状毛霉(Mucorracemosus)是毛霉中分布最广的一种，几乎在各地土壤中