配子与胚胎生物工程-南农大

第九章配子与胚胎生物工程,第一节配子与胚胎生物工程概述第二节胚胎移植技术第三节其他胚胎工程技术概述,1.定义,配子与胚胎生物工程也称胚胎生物技术或胚胎工程技术，主要是对动物的卵子、精子和胚胎在体外条件下进行各种操作，以加速繁育经济动物，培育优良品种，或挽救濒危动物使用的一系列工程技术方法,第一节配子与胚胎生物工程概述,卵子,精子,受精,2.研究内容,胚胎移植胚胎分割胚胎冷冻体外受精胚胎干细胞技术,转基因技术动物克隆性别控制嵌合体技术,母,公,排卵,精子,自然交配,人工授精,体外授精,发情鉴定,精液保存,精子获能,IVM,显微授精,精卵结合,胚胎,胚胎干细胞,胚胎分割,胚胎移植,胚胎克隆,嵌合体,转基因,诱导发情,超数排卵,同期发情,妊娠,妊娠诊断,分娩,分娩控制,助产,难产,生殖免疫,免疫去势,类固醇免疫,蛋白质免疫,基因免疫,性别控制,分子技术,3.研究意义,是提高动物生产性能的主要技术措施之一,奶牛业,乳用型荷斯坦牛的产奶量为各奶牛品种之冠乳牛业发达国家奶牛单产：11吨。品种改良：提高单个奶牛产奶量性别控制：以生产母牛犊谋利,肉牛业,牛肉人均占有量中国只有4.09千克,与牛肉人均占有量最多的国家澳大利亚250.8千克，阿根廷71.09千克,美国42.74千克,加拿大41.25千克相比，中国牛肉的人均占有量低于世界平均水平。,受体黄牛与胚胎移植生产的良种肉牛,（江苏省农业三项工程项目）,养猪业,山羊胚胎移植产业化,人工授精、试管牛犊、冷冻胚胎、胚胎分割等胚胎工程技术大大加快了畜牧业的发展速度，使得家畜优良品种的生产商品化了。1987年世界上已经有家畜胚胎移植公司200多个，如美国已建立了从事牛胚胎移植、精子冷冻、受精卵分割等技术研究的格拉纳达公司，已发展成资产10亿美元的跨国胚胎企业。,揭示胚胎发育、细胞分化等奥秘的研究手段新物种产生的主要技术途径生物制药的主要技术措施之一：胰岛素人类器官移植、修复、再生的主要技术途径人类人工辅助生殖的重要研究手段珍稀濒危动物保护、扩繁的主要手段：克隆，胚胎冷冻等,胚胎工程不仅蕴藏着巨大的经济效益，同时对保护珍稀动物和挽救濒临灭绝的野生动物也发挥着重大作用。例如，英国伦敦动物学院和剑桥动物良种繁殖动物学会合作，把斑马的胚胎移植到普通马的子宫里，这匹普通马生出了一批小斑马。,中国科学院动物研究所的科研人员研究大熊猫的体外受精取得了很大进展，这将给人工繁殖大熊猫带来希望。,人类生殖医学,人类生育能力下降：人类将可能面临生育危机，或许这种说法有点危言耸听，但是我们不得不面对这样一个事实：据WHO统计，大约每七对夫妇中就有一对存在着各种程度的生育障碍。男性精液质量在近几十年里有着明显的下降，并且还有逐年递增的趋势。人工辅助生殖技术:试管婴儿和AI,试管婴儿技术,2008.2.25，中国首例试管婴儿（郑萌珠）20周年庆典,人造血液,据英国泰晤士报2008年8月20日报道，美国先进细胞技术公司的科学家们日前宣布，他们已在实验室中利用干细胞制造出人造血。倘若这一研究成果能继续推广，人类将从此结束献血，血液可以被源源不断地创造出来。也令输血感染致命病毒的风险不复存在。,耳朵老鼠,动物胚胎工程技术是动物生物技术的重要组成部分之一，在二十世纪后期发展极为迅速，近年来其应用效益最为显著，也是21世纪世界经济增长的重要支撑技术之一。,总之，体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎干细胞的培养等胚胎工程技术，不仅广泛应用在畜牧业生产中，而且与医学、制药业等的发展，以及人们的生活有着越来越密切的关系。,第二节胚胎移植,一、胚胎移植技术概述二、胚胎移植的意义三、国内外发展概况四、胚胎移植的基本原则五、牛胚胎移植操作步骤六、山羊胚胎移植概述,八戒飞抵岛城跨国娶妻,加拿大846头猪运抵青岛，价值190万美元（2007-10-17）成本高，时间长，可用ET代替活体引种。,一、胚胎移植技术概述,1.定义胚胎移植是指将一头良种母畜配种后的早期胚胎取出（或通过体外受精及其他方式得到体外生产的胚胎），移植到另一头同种且生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体的过程。实际上是由产生良种胚胎的供体和养育胚胎的受体分工合作共同繁殖后代的技术。,牛胚胎移植技术路线示意图,着床前早期胚胎的游离状态；不同个体（物种）早期胚胎发育内环境相似；不会发生免疫排斥,2.理论基础,发挥优良母畜繁殖潜力。羊每年自然繁殖：23只，胚胎移植：1015只。山羊繁殖供体生产胚胎受体妊娠分娩后代,二、胚胎移植的意义,充分发挥优良母畜的繁殖潜力，扩大良种畜群加速育种进程简化良种引进方法保存品种资源诱发单胎动物产双胎研究手段,在胚胎移植中，供体母畜职能是生产遗传性能优秀的胚胎，而胚胎后期发育完全可以由遗传性能一般的代孕受体来完成。母畜再通过促性腺激素处理后，一个发情周期中生产的胚胎数将比自然状态多几倍到几十倍，通过胚胎移植其繁殖力可提高几十甚至是几百倍。,1.充分发挥优良母畜的繁殖潜力，扩大良种畜群,以奶牛为例，按照目前的技术水平，供体母牛每隔60d可进行超排处理一次，每次能获得可用胚胎4-5枚，一头良种母牛每年能生产可用胚胎25-30枚，移植到受体内能获得12-15头犊牛，而在自然状态下，一头母牛平均每年只能获得一头犊牛。,JIVET技术简介,JIVET：juvenileinvitroembryotransfer幼畜胚胎体外生产与移植,激素诱导后的犊牛卵巢,充分利用优良母畜的遗传资源(多)缩短世代间隔，加快育种进程（快）,2.加速育种进程,MOET(multipleovulationandembryotransfer)技术能大幅度提高母畜繁殖力，扩大优秀母畜在群体中的影响，增加后代选择强度。如在奶牛育种中，MOET技术能获得更多具有高产性能的半同胞和全同胞，在较短的时间内达到后裔测定所要求后代的数量，提早完成后裔测定工作，增加选择强度和准确性，缩短育种进程。,应用MOET核心群育种方案，公牛的遗传评定时间可缩短40，生产性状的年遗传进展比常规的人工授精提高20左右。如果在青年母牛或母羊中应用活体采卵和胚胎移植技术，年遗传进展可提高30-70。,3.简化良种引进方法,活畜引进不仅价格高、运输不便、检疫和隔离程序复杂，而且还存在风土驯化的问题。胚胎移植与胚胎冷冻技术相结合后，良种的引进可简化为冷冻胚胎的引进，不仅运输方便、检疫程序简单、成本低廉，而且后代对引种地生态环境适应性和抗病力增强。目前，牛羊胚胎移植与冷冻技术已成为国际、地区间良种遗传资源交流廉价而简便的方式。,4.保存品种资源,结合胚胎冷冻技术为可保存国家或地区间特有的家畜品种资源，建立种质资源库提供新的技术手段，还可降低种质资源保存费用。活畜保种不仅成本很高、规模有限，而且还容易发生基因漂变。胚胎冷冻保种也优于精液冷冻保种，因为一个胚胎是一个完整的个体，这样，冷冻或冷藏一个胚胎不仅保存了一个个体的基因，也保存了基因组织。,而且要从精子中重新构建一个已经灭迹了的群体，需要级进许多世代，而通过胚胎再构建一个群体，仅在一个世代内即可实现。胚胎冷冻保种不仅成本低廉、方法简单，而且能避免活畜保种因疾病、自然灾害或基因漂变造成种质消亡的风险。,5.诱发单胎动物产双胎,性别控制避免异性孪生不育症,6.研究手段,目前，胚胎工程技术中应用最多的是胚胎移植技术，无论是转基因胚胎还是克隆等获得的胚胎，最后都必须经胚胎移植才能获得后代，胚胎移植是胚胎工程的最后一道“工序”。因此，可以说它是胚胎工程技术的基础。,三、国内外发展概况,胚胎移植技术是20世纪畜牧业中继人工授精技术之后又一次巨大变革，业已成为一项充分发挥优良母畜繁殖潜力的实用繁殖新技术。1951年，美国诞生第一头胚胎移植犊牛。1976年，牛非手术法胚胎移植获得成功。,1.胚胎移植历史,1890年英国第一次兔获得胚胎移植成功1934年绵羊1949年山羊1951年猪1951年牛1970年马1975年1月美国丹佛召开第一届国际胚胎移植学会1980年代欧洲使用MOET奶牛育种,国际间胚胎贸易非常活跃，早在1994年，全世界仅胚胎移植牛就已超过350,000头，其中进出口的胚胎约占总数的10%。近年来，国际上胚胎的产量和贸易量则成倍增长。,2.发展前景,我国胚胎移植技术已较成熟，基本技术队伍初步形成。农业产业结构的调整，畜牧业发展形势一片大好；胚胎移植技术作为扩大良种牲畜数量的一种最好手段，将在畜牧业生产中起到越来越大的作用，胚胎移植技术产业化前景十分广阔。,四、胚胎移植的基本原则,移植前后所处的环境应是相同或相似的移植的时间要适宜胚胎的发育应当正常,供体和受体在种属上必须一致；供体和受体在生理上必须一致：供、受体在发情时间上应同期化，一般相差不超过24h，否则移植成功率显著下降；从供体中收集胚胎的部位与给受体移植胚胎的部位必须一致：即从供体子宫角内收集到的胚胎应该移植到受体的子宫角内。,1.移植前后所处的环境应是相同或相似的,Follicular(egg)development,hormonalchanges,endometrial(uterinelining)changes,胚胎收集与移植的时间不能超过周期黄体的寿命，因此，胚胎的收集时间不能超过发情配种后第7天，最好是在发情配种后的第5-7天内进行。,2.移植的时间要适宜,胚胎的收集及移植过程应当严格按照要求进行，尽量不使其受到物理、化学或生物方面的影响。同时，胚胎移植前需进行鉴定，确定其发育正常者才能进行移植。,3.胚胎的发育应当正常,五、牛胚胎移植操作步骤,供、受体牛的选择供体的超数排卵与人工授精受体的同期发情胚胎的收集胚胎的检查和评定胚胎的移植,1.供、受体的选择,供体应是良种，而且为性状表现优秀、具有较高育种价值与遗传优势的个体；供体应健康无病，膘情中等偏上，年龄以青壮年为佳；供体生殖机能应处在较高水平。既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，超排处理前应有两个或两个以上的正常情期。,1.1供体母畜的选择,一般选用价格低廉、生产性能比较低的同种母畜，达到配种年龄和体型；要具有良好的健康状态，体型与膘情中上等，初产或经产青壮年母畜。检疫和疫苗接种与供体相同；应具有良好的繁殖性能，既无难产、流产等繁殖病史，也无子宫卵巢疾病，移植胚胎前应有两个或两个以上的正常情期，也不能与公畜同群。,1.2受体母畜的选择,2.1超排定义在母畜（供体）发情周期的某一时期，用外源性的促性腺激素处理，从而促使其卵巢上较正常有更多个卵泡同时发育，并且能够同时或准同时排出多个具有受精能力的卵子，这一技术称为超数排卵，筒称“超排”。,2.供体的超数排卵与人工授精,牛有PG+FSH法和CIDA+FSH法两种；发情后913天开始；常用的激素为FSH；注射方法一般是连续4d递减注射,每天2次,间隔12小时（半衰期短）；发情后812小时配种，间隔12小时再配种一次。,2.2超数排卵方法,在发情周期第10、11、12、13天每头牛分别肌注FSH160、140、110、90单位（共500IU)，每天分两次注射，在第12天注射FSH的同时肌注PG，上午2支/头，下午1支/头。发情后供体AI或配种2-3次。,供体牛的超排方案,3.受体的同期发情,3.1定义利用某些外源激素人为控制并调整一群母畜发情周期的过程,使之在预定的时间内集中发情,以便有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化处理方法,也称同步发情。,缩短黄体期的前列腺素法(PG法)延长黄体期的孕酮法,3.2同期发情方法,PGF2有溶解黄体的作用，从而引起发情，所以只对卵巢上存在黄体的受体有效。在情期第9天以后，注射PGF2，常可在注射后2-3天内发情(WHY?)。对于不能确定发情周期的受体，可采用间隔10-12天的两次注射法。此方法方便可靠，但费用较高。为何要进行两次注射？,3.2.1前列腺素处理法,s,母牛发情周期,第7-17天，对前列腺素（PG）有反应,孕酮能够抑制腺垂体释放FSH，每日肌注或口服孕酮，或经阴道海绵栓给予孕酮或其类似物，一般处理12-18天后，可以抑制卵泡发育。停止处理或撤除海绵栓后，孕酮的抑制作用消失，卵巢上即有卵泡发育，通常在2-3天内发情。为了提高排卵的效率，在孕激素处理结束的前一天，可以给予小剂量的FSH。此法费用低，但处理时间长。,3.2.2孕激素处理法,4.1冲胚液和保存液的制作冲胚液有很多种，目前最常用的为含5%犊牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS），也可用于体外短期保存胚胎。保存时间长或体外培养多用M-199液。,4.胚胎的收集,4.2回收过程牛适宜于5-7日龄胚胎;现均采用二通管非手术采卵法：用直肠把握子宫颈法插入带有探针的二通管直至一侧子宫角的基部，通过打气孔注入8-10ml空气,抽出探针，通过中心管道反复注入-回收冲卵液,连续5-6次。同样方法冲另一侧子宫角。,PBS,集卵杯,子宫颈,子宫角,卵巢,牛的非手术法回收胚胎a.冲卵液b.硬膜外麻醉c.插入子宫中的Foley管d.子宫颈,子宫角回收的液体较多，可以通过专用胚胎漏斗除去多余的冲卵液，在连续变倍解剖显微镜（实体显微镜）下进行检胚；胚胎的质量评定：主要采用形态学方法，优质胚胎才能用于进行胚胎冷冻或移植。,5.胚胎的检查和评定,A级;形态完整,轮廓清晰,呈球形,分裂球大小均匀,透明带适中；B级;轮廓清晰,色调和细胞密度良好；C级;轮廓不清楚,色调发暗,结构较松散,游离的细胞和液胞较多；D级;轮廓模糊,色调暗,结构松散,碎片细胞和液泡很多。,5.1胚胎的分级标准,5.2不同发育阶段的正常胚胎,5.3未受精卵或异常胚胎,2-cell,4-cell,8-cell,16-cell,Morula,Blastocyst,5.4正常胚胎的形态,6.胚胎的移植,重点应检查子宫和卵巢的异常情况以及子宫的紧张性，然后检查卵巢上黄体的发育情况（位置、大小），只有黄体发育良好者才能正式列为待移植母牛，并记录和在牛臀部标出黄体位于左右哪一侧。牛站立保定于六柱栏保定架内，用2%盐酸利多卡因或普鲁卡因进行荐尾椎硬膜外麻醉，用18号针头，每只牛约5ml。,6.1受体母牛的准备,1.1ml注射器2.装管接头3.细管A.棉塞B.气泡、保护液.含胚段,装管器械和装管方法,6.2胚胎的移植方法,直肠把握法,2003年9月4日降生的良种胚胎移植牛,（江苏省农业三项工程项目）,受体黄牛与胚胎移植生产的良种肉牛,（江苏省农业三项工程项目）,外国专家来访,外国专家来访,六、山羊胚胎移植概述,山羊胚胎移植产业化,1.1超排方案超排方案1(FSH+PG法)：从供体发情周期的第9-13天开始注射FSH，以日递减剂量连续注射3天6次，每次间隔12小时,总剂量为150-300IU，在第5次注射FSH的同时肌注氯前列稀醇0.1毫克。,1.供体的超数排卵技术,超排方案2(CIDR+FSH+PG法)：在发情周期的任何一天给供体阴道内放入CIDR，计为0天，然后于第9-13天任何一天开始肌注FSH，递减法连续注射3天共6次，在第5次肌注FSH时取出CIDR，并肌注氯前列稀醇0.1毫克，一般在取出CIDR后24-48小时发情。,2.胚胎的回收,场所、器械和人员的准备供体羊的术前准备：术前1日停止喂食但不停水；术部剃毛；麻醉现多用速眠新全麻；术部皮肤先用2%-4%的碘酒消毒，晾干后再用70%-75%的酒精棉涂擦脱碘。将创巾固定在术部周围并露出术部。,2.1术前准备,2.2手术过程皮肤用外科刀一次切开，4-6厘米。肌肉用钝性分离的方法沿肌纤维的走向分层切开，最后切开腹膜。注意及时止血。手术者将食指及中指由切口伸入腹腔触摸子宫角，用二指夹持，因势利导地牵引至创口表面，先循一侧的子宫角至该侧的输卵管，在输卵管的末端弯转处找到该侧的卵巢，观察卵巢表面的排卵点和卵泡发育情况并做记录。,2.3冲洗输卵管法适宜于2-3日龄的胚胎。将一根长5-7cm，外径3-4mm的硅胶管插入输卵管喇叭口内1-1.5cm，用血管夹或手固定。以左手母指和食指捏住子宫角前端，右手持吸有冲卵液的针管并将针头插入子宫角尖端，注入冲卵液约10-15ml。,输卵管回收胚胎示意图,供体的冲胚,2.4冲洗子宫法适宜于5-7日龄胚胎。,子宫角回收胚胎示意图(1),子宫角回收胚胎示意图(2),用作受体的母畜应具有明显的发情症状，发情时间应与供体母畜一致。羊采用手术法移植。受、供体同时做好术前准备，在进行胚胎检查的同时或之后，立即在受体母畜腹部做一切口，轻轻拉出子宫角，找到排卵侧的卵巢并观察黄体数量与发育情况。,3.胚胎的移植,只有黄体发育良好的受体才能用于胚胎移植，黄体过小、发育异常或退化的受体都不能用于胚胎移植，否则很难受孕。卵巢上有1个黄体的受体一般只给移1枚胚胎，有2个或2个以上黄体者可以移2枚胚胎。,根据胚胎的发育阶段以及回收与移植部位一致的原则，用移植管将胚胎注入黄体同侧子宫角前端或通过喇叭口送至输卵管壶腹部（如图），然后迅速复位、缝合。注意：保护受体卵巢黄体。,山羊手术法移胚A.子宫移胚器B.子宫角移胚C.输卵管移胚1.移植针2.硅胶管3.吸有胚胎的细管,麻醉、固定,刮毛,消毒,供体的手术,超排后的黄体,非正常的卵巢：大卵泡,供体的冲胚,检胚,移植胚胎,缝合,供体受体的解麻,受体与产的羔羊,南京农业大学动物胚胎工程技术中心常州基地,胚胎分割胚胎冷冻体外受精胚胎干细胞,转基因技术动物克隆性别控制嵌合体技术,第三节其他胚胎工程技术概述,通过对胚胎进行显微操作，将一枚胚胎用显微手术等方法分割成二分或四分胚,经体内或体外培养,然后移植入受体中,以得到同卵双生或同卵多生后代的技术。胚胎分割是扩大胚胎来源的一条有效途径，其理论依据是早期胚胎的每一个卵裂球都具有独立发育成个体的全能性。,1.胚胎分割,2.胚胎冷冻,胚胎的冷冻保存，是将胚胎贮存在196超低温下长期保存的方法。20世记70年代试验成功是胚胎移植技术的重大突破，使胚胎移植不受时间和地点的限制，从而扩大了胚胎移植技术的效率。是长期保存优良母牛基因最可靠的技术措