微生物工程实验课件

微生物工程综合大实验,汇报人：马小魁马小魁西安石油大学二一一年一月,微生物工程实验设计要求,据实验内容，确定实验步骤，根据实验准备、设计实验方案,方法：1、学习原理，掌握关键点，图示实验原理。2、研究实验目的，确证实验内容，明确实验重点。3、根据实验内容和目的，自行设计实验步骤。4、对比实验教材，分析实验设计差距，尤其原因。5、按教材设计具体实验步骤，课堂上分组按人组织实验内容安排，各司其职，完成实验内容。注意客观描述实验现象，不主观、不唯书。6、及时书写实验报告，客观书写实验现象，分析实验中存在所有问题，解决问题。7、回馈分析：根据实验报告，再行对自己设计实验进行对照，提高实验设计水平。,实验报告,实验报告总体要求：规范、突出重点，客观、反映实验本质,1、实验目的：用关键词表述，不要冗长、拖沓。2、实验原理：简单、明了、突出自身理解，不抄书。3、实验材料：不抄书、用专业术语反映主要器材。4、方法步骤：建议用规范的实验示意图表述主要实验过程，突出说明试验中的关键点操作和注意事项。步骤阐述，重点突出、保证有的放矢。5、结果：表述要客观、实际，不带主观。要对实验过程中出现的客观现象如实记录，并附原始图片、资料。绝对禁止网上图片代替或抄录他人图片。6、分析讨论：报告重点。对实验结果和实验过程中出现的例外或现象进行分析。并能引用文献或书本知识进行阐述、分析。倡导言之有物，忌无病呻吟，言之无物。7、思考题：对书本或老师布置作业要认真做创新回答，忌抄书雷同。,工程实验具体要求,参照教学要求部分内容，遵守本组实验规范，不违反规范,1、进入室内，更衣、将随身物品放入准备间。忌带食品，严惩不贷。2、对于压容设备，不得随意使用。禁止非规范操作室内任何设备。3、实验操作，要求规范、严格按照相关要求进行，禁止实验过程中喧哗、打闹。一经发现，取消本次实验资格。4、实验过程中做到干净整洁、不随意仍废弃物或个人物品，保持工作面整洁。5、实验过程要做到“手快、眼捷、心静”，强调实验过程协调、规范。6、进入室内：更衣温习实验内容听课设计自身实验方案领取物品组内分配任务，强调各司其职，共同学习7、特殊设备使用，必须在实验老师指导下使用，压力设备使用要规范、安全、严禁随意使用。值日按组进行，等老师验收后方可离开。,实验青霉素发酵综合大实验,（一）青霉素发酵斜面的制备与接种,一、实验目的1、掌握斜面的制备和接种的基本操作。2、了解青霉素发酵的一般知识。二、实验原理1、培养基2、灭菌方法3、摆斜面4、工业微生物斜面试管菌种：点种、中央划线、稀波状蜿蜒划线、密波状蜿蜒划线、挖块接种,三、实验材料1、菌种产黄青霉（Pencilliumchrysogenum）。2、培养基察氏固体培养基3、器材天平，高压蒸汽灭菌锅，超净台，培养箱等,实验二青霉素发酵综合大实验,（一）青霉素发酵斜面的制备与接种,四、方法步骤（1）固体培养基的配（2）分装（3）湿热灭菌操作步骤（4）斜面的制作（5）培养基的灭菌检查（6）斜面接种具体操作：A、在准备好的超净台上，从活化后的菌种斜面分别将一定量的菌种采用密波状蜿蜒划线法接种到经无菌检查的斜面培养上B、在25下培养67天，待斜面上长满菌落后，经镜检确认为纯种后即作为一级斜面菌种。每组接种1-3支,实验二青霉素发酵综合大实验,（一）青霉素发酵斜面的制备与接种,结果和思考题,结果分析1、描述和记录产黄青霉菌在培养过程中生长和现象2、画图记录菌种菌落形态和镜检结果。思考题1、高压蒸汽灭菌微生物比干热灭菌要求温度低、时间短？2、斜面菌种转接之前为何需要活化？3、请结合理论课讲述，阐述斜面菌株质量好坏对菌种扩大过程的重要性。,（一）青霉素发酵斜面的制备与接种,一、实验目的,1、复习青霉素作用机理2、掌握青霉素效价的生物学测定的原理3、掌握管碟法测量抗生素效价的方法4、掌握青霉素摇瓶培养的操作流程二、实验原理1、青霉素及作用机理：主要含有：青霉素F、G、X、K和双氢F五种。以青霉素G的作用最强，它会抑制细菌细胞壁的生成。,综合实验：（三)青霉发酵效价的生物学测定,二、实验原理（续）,2、青霉素使用常识：青霉素钾盐、钠盐的性质：遇酸、碱或氧化剂等迅速失效。在水中极易溶解，乙醇中可溶解，在脂肪油或液状石蜡中不溶。水溶液在室温放置易失效。（所以要求咱们实验过程中要先配现用）3、抗生素效价测定：效价:是评价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度1）、抗生素效价的生物学测定方法有稀释法、比浊法、扩散法三大类。2）、琼脂平板扩散法（又称管碟法）：利用抗生素在琼脂平板上的扩散渗透作用，将已知浓度的标准溶液与未知浓度的样品溶液在含有敏感性实验菌株的琼脂表面进行扩散渗透，比较两者对被试菌的抑菌作用，求出抑菌圈的大小，以测定青霉素的效价。,综合大实验：（三)青霉发酵效价生物学测定,实验原理（续）：琼脂平板扩散法,具体而言，它是将规格一定的不锈钢小管置于带敏感菌的琼脂平板上，在管中放入被测液，在室温下扩散一段时间后放入温箱中培养。在菌生长的同时，产生透明抑菌圈。在一定范围内，抗菌物质的浓度与抑菌圈的直径成直线关系；因此，根据抑菌圈的大小可以求出相应的抗菌物质的效价。此法多被列于各国药典的测定方法中。理论上注射用青霉素G钠1mg=1670单位，青霉素G钾1mg=1598单位。其它青霉素均以mg为剂量单位。1000/1667mg=0.6mg1000单位100ml1000单位/ml100*0.6mg=0.06g称取60mg苄青霉素钠溶于100ml的磷酸缓冲液,综合大实验：（三)青霉发酵效价生物学测定,实验材料和器皿,菌种产黄青霉（Pentcilliumchrysogenum），测定用指示菌金黄色葡萄球菌培养基：发酵培养基、生物测定培养基器皿：摇床，三角瓶（300毫升），不锈钢管（即牛津小杯，内径61毫米，外径80.1毫米，高100.1毫米），平皿（直径90毫米，要求大小一致，皿底平坦），离心机，分光光度计，滴管，容量瓶等。试剂：1%pH6.0磷酸缓冲液：K2HPO40.2g,KH2PO40.8g），蒸馏水1000毫升；0.85%生理水、苄青霉素钠盐。,综合大实验：（三)青霉发酵效价生物学测定,三、实验步骤和方法：青霉素发酵效价测定的标线绘制,1、金黄色葡萄球菌菌悬液的制备：将37培养16-18小时的斜面菌种，用0.85%的生理盐水洗下，离心沉淀，倾去上清液，沉淀菌体再用生理盐水离心洗涤1-2次，最后将菌悬液稀释至18-21亿/毫升（或用分光光度计在波长650nm测透光率20%）。2、青霉素标准溶液的配制：准确称去纯苄青霉素钠多少毫克，溶解在pH6.0的磷酸缓冲液配成10单位/毫升的青霉素标准工作液。按下表加入青霉素标准溶液。不要配太多。,综合大实验：（三)青霉发酵效价生物学测定,表1绘制标准曲线用的不同浓度青霉素液配制法,综合大实验：（三)青霉发酵效价生物学测定,三、实验步骤和方法：青霉素发酵效价测定的标线绘制,3、生物测定培养基的制备：首先取灭菌平皿15套，每皿用大口吸管吸取已冷至45左右的下层培养基12-15毫升，水平放置，待凝固后再加入含菌上层培养基3-5毫升，将培养基来回倾倒，使含菌培养基分布均匀。在超净台中倒平板。注意：上层培养基是使用前要冷至50，每10毫升培养基内加入金黄色葡萄球菌悬液0.3-5毫升，充分混均匀，在50水浴中放置10分钟后使用。,综合大实验：（三)青霉发酵效价生物学测定,实验步骤：青霉素标准曲线的绘制,等上层培养基完全凝固后，在每个琼脂平版上轻轻放置不锈钢小管3-4个，小管之间的距离要相等。然后用带有橡皮头的滴管将青霉素标准溶液滴加于小管内（滴满但不外溢）或用枪加200微升，每一浓度做三个重复。等青霉素加完毕后，换上陶盖，移至37恒温箱中培养18-24小时后，移去小管。精确的测定抑菌圈的直径大小，并将数据填于表2。计算：算出各组抑菌圈直径平均值。算出各组10单位/毫升抑菌圈直径平均值。算出12套平皿中10单位/毫升抑菌圈直径平均值。以1单位/毫升抑菌圈直径总平均值来校正各组10单位/毫升抑菌圈直径平均值，求得各组的校正数。以校正值数校正各剂量点的抑菌圈直径，求得校正值。,综合大实验：（三)青霉发酵效价生物学测定,青霉素效价测定和计算：,摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基,25、200rpm培养6-7天,可进行青霉素的效价测定等计算将青霉素标准工作液（100单位/毫升）之抑菌圈直径进行校正，以求取校正值。将此校正数校正检品的抑菌圈直径，求得检品抑菌圈直径的校正值。将校正值在标准曲线上查得检品的稀释液的青霉素的效价值。将此校正值在标准曲线上查得检品稀释液的青霉素效价.,综合大实验：（三)青霉发酵效价生物学测定,实验结果和思考题,1.分别完成2张表格的填写2.选择应用计算机绘图软件以青霉素浓度(对数值)为横坐标,以抑菌圈直径的校正值为纵坐标绘制标准曲线思考题：1、抗生素测定中为什么常用琼脂平板扩散法？2、如何用计算机软件绘制青霉素标准曲线？试着手绘一下看和机绘制的标准曲线有什么不同。,综合大实验：（三)青霉发酵效价生物学测定,实验目的：,1、培养基优化的原理和试验设计方法2、通过实验确定青霉素发酵的较适培养基实验原理：1、掌握培养基组配的技术和原理A、碳源、氮源：同化能力。由于存在葡萄糖效应或称为分解产物调节，考虑产黄青霉生长和二次代谢产生青霉素等几方面的因素，生产上一般采用流加葡萄糖、直接加入乳糖或采用二次碳源的添加方式提供糖源。B、代谢的阻遏和诱导：C、合适的C、N比：菌丝体生长阶段氮源需求高;孢子生长阶段氮源需求低。碳源和PH值的关系。D、pH调制：考虑其代谢后对培养体系pH缓冲体系的影响。,综合大实验：（四)青霉素发酵培养基正交优化试验,实验原理：,2、培养基优化基本原理A、菌体生长和产物合成模型。B、青霉发酵属于典型的非生长偶联模型，菌体生长和产物合成工艺需要分阶段优化。3、发酵优化方法：正交实验设计方法（请参见另外实验技术篇讲解）单因子实验确定培养基的组成；多因子实验确定各成分对培养基的影响大小及适宜浓度。多因子:通过较少的实验次数获得所需的结果,正交实验设计、响应面分析等,综合大实验：（四)青霉素发酵培养基正交优化试验,实验材料和器皿,菌种产黄青霉（Pentcilliumchrysogenum），测定用指示菌金黄色葡萄球菌培养基：发酵培养基、生物测定培养基器皿：摇床，三角瓶（300毫升），不锈钢管（即牛津小杯，内径61毫米，外径80.1毫米，高100.1毫米），平皿（直径90毫米，要求大小一致，皿底平坦），离心机，分光光度计，滴管，容量瓶等。试剂：1%pH6.0磷酸缓冲液：K2HPO40.2g,KH2PO40.8g），蒸馏水1000毫升；0.85%生理水、苄青霉素钠盐。,综合大实验：（四)青霉素发酵培养基正交优化试验,实验方法和内容：,利用正交设计软件设计优化配方。对其发酵中添加苯乙酸、磷酸氢二钾、乳酸铵的加入量进行优化。接种菌悬液的制备：无菌操作接种培养：将菌悬液用无菌吸管接入各无菌三角瓶培养基中扎好棉塞，置恒温摇床中震荡培养6-7天，培养温度28。培养过程中注意观察控制温度。青霉素发酵效价测定：按照测定步骤测定各个三角瓶青霉素的效价水平，比较各培养基配方不同的发酵效率和产率。金黄色葡萄球菌菌悬液的制备:将37培养16-18h的斜面菌种,用0.9%的生理盐水洗下，将菌悬液稀释至波长650nm透光率为20%的溶液。测定平板制备:培养基400ml,加入适当稀释的金黄色葡萄球菌后,制成12个平板.,综合大实验：（四)青霉素发酵培养基正交优化试验,青霉素发酵液效价测定:发酵结束后5000rpm离心5min每个被测样品用3套平皿进行测定；37培养18-24h后,量取抑菌圈直径的大小。青霉素标准工作液（1单位/毫升）与检品的稀释液间隔的加于小管内。填写正交实验表格,用极差法或方差分析法确定最适培养基配方。选择正交表安排设计试验摇瓶振荡培养法安排实验测定青霉素发酵效价水平用极差法或方差分析法分析试验数据，确定最适培养基配方。,实验方法和内容,综合大实验：（四)青霉素发酵培养基正交优化试验,实验报告,青霉素发酵效价测定标准曲线的绘制：报告中要包括完整绘制标准曲线的各项图表和数据。正交表设计实验：报告中要包括有选择的表头及相应的培养基配方。发酵水平评价：根据各三角瓶不同的发酵效价水平，得出最佳的青霉素发酵培养基配方；报告中要包括有正交表分析、极差或方差数据、及因素水平效应图。,综合大实验：（四)青霉素发酵培养基正交优化试验,思考题,在实验中，你觉得如何保证接种过程中没有杂菌污染？青霉素效价测定中如何减少误差？并从统计角度分析如何保证你的标准曲线准确。在三角瓶震荡培养过程中，你觉得如何对其进行发酵控制？结合已学发酵控制的相关知识加以设想和讨论。尝试将你的正交分析表的所有分析过程用正交设计分析助手软件分析一下，看有没有区别，为什么？,综合大实验：（四)青霉素发酵培养基正交优化试验,综合大实验：GUCS10型磁力搅拌发酵系统,综合大实验：（五）发酵罐的构造及操作,实验目的：了解发酵罐的结构、发酵罐空消操作步骤,实验内容发酵罐构造：以GUCS10型磁力搅拌发酵系统为模型了解其结构部分以及各部分的功用。发酵罐空载时的灭菌操作步骤：在保证安全条件下示范自动发酵罐的空消流程和具体操作。发酵罐空载时的灭菌注意事项实验报告简述GUCS10型磁力搅拌发酵系统操作规程，并画图表述几大系统的结构和操作规程发酵罐空消应注意那些问题？,实验目的,1、学习和掌握发酵过程中的取样操作2、了解发酵过程中还原糖的各种测定方法，熟练掌握NDS法测定的操作方法及注意事项3、了解青霉素发酵过程中还原糖对发酵效价的影响,综合大实验：还原糖测定,实验原理,（一）发酵过程中的取样操作取样操作是发酵过程中在线控制的重要内容；只有通过取样才能对发酵过程中的诸多参数进行测定，以求进一步的控制。操作要注意动作协调、快速，不能造成发酵罐污染，严格按照相应程序进行。盛放样品的器皿也要纯净、无菌，以防止杂质对测定结果的影响。（二）发酵过程中的还原糖的测定发酵过程中的还原糖浓度是进行发酵控制的重要参考数据，补料、放罐、防止噬菌体污染等工艺操作都要参考此数据进行。准确的测定发酵过程中还原糖的浓度变化对发酵工艺控制有重要意义。,综合大实验：还原糖测定,DNS法,DNS法即3，5-二硝基水杨酸法，原理是3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热生成棕红色的的氨基化合物，还原糖的量与棕红色物质的深浅成一定比例关系，通过此比例测定还原糖的含量。菲林试剂法菲林试剂由质量浓度为0.1g/mL的NaOH溶液和质量浓度为0.05g/mL的CuSO4溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的Cu(OH)2沉淀。Cu(OH)2在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红色的Cu2O沉淀，醛基则被氧化为羧基,综合大实验：还原糖测定,方法比较：,由于菲林法测定的结果会随青霉素的效价的增大而增大，但由于其它还原性物质也易产生干扰，两者之间没有比例关系，青霉素的存在严重干扰了菲林法测定结果；而且滴定终点往往判断不准，引起很大误差。DNS法测定结果准确，比菲林法更具参考价值。而且操作的复杂程度与菲林法相当，使用比色法测定避免了菲林法滴定重点判断不准引起的误差。此法在研究和生产中应用广泛，要完全掌握。酶法专一性强，结果准确，适宜精确测定，但成本较高。生产中也用邻甲基苯胺法测定青霉素发酵液中还原糖含量。,综合大实验：还原糖测定,三、实验材料和器皿,分析试剂DNS显色剂每1000mlDNS溶液含有酒石酸钾钠182g无水亚硫酸钠3g氢氧化钠20g3,5二硝基水杨酸6.3g重蒸馏酚4g配后过滤放置半月后使用1葡萄糖标准溶液：准确称取100mg葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后定容至100ml，冰箱保存备用10ZnSO4溶液实验仪器和器皿分光光度计，定糖管，移液管，容量瓶，烧杯，电炉等,综合大实验：还原糖测定,四、方法步骤,1、葡萄糖标准曲线的绘制9只定糖管，分别按照下表顺序加入各种试剂，沸水浴中加热5min，后立即流动水冷却管内溶液混匀，用空白管溶液调零点，520nm测定光密度值,以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制葡萄糖溶液标准曲线。一组同学做一个标准曲线。2、青霉素发酵液取样按照发酵罐取样的操作规程取样（或在发酵三角瓶中取样），并用已刷洗干净的三角瓶盛放。,综合大实验：还原糖测定,3、青霉素发酵液还原糖浓度的测定,取一定体积的青霉素发酵液在2000rpm下离心分离去除产黄青霉菌丝体，准确称取5-10毫升发酵上清液（视含糖量高低而定，在发酵周期内不同时期取样数量应有不同）于100毫升容量瓶中，加入10毫升10%硫酸锌溶液，用碱液（3mol/l）调节显酸性，以水稀释至刻度，摇匀，通过干燥滤纸过滤，吸取10毫升滤液在容量瓶中稀释至50毫升，然后按表2加入相应试剂进行反应后，再将各管溶液混匀，在721型或751型分光光度计（波长520nm）上进行比色测定；测定时先用空白管调零后，再依次测定记录各管的光密度值；最后根据葡萄糖的标准曲线算出发酵液所含还原糖的量。每管要求测定三次，求平均值。,综合大实验：还原糖测定,注意事项,定糖管的管口在加热时绝对不可朝向人，以免糖液过度沸腾飞溅伤人。葡萄糖标准曲线绘制要准确，尽量符合统计意义(R297%);如果绘制时浓度点过度分散要再做一次。青霉素发酵液所含的还原糖浓度不过大，如果过大要将稀释倍数增大。测定发酵液的光密度值时，尽量使测定的值分布在中间刻度处，提高测定的准确度。为了测定准确，测定过程要严格空白操作，且要注意平行操作测定。,综合大实验：还原糖测定,实验结果报告和思考题,1、葡萄糖标准曲线的绘制图。2、用图完整表示青霉素发酵液还原糖测定时所用的添加试剂及操作顺序。3、根据葡萄糖标准曲线算出青霉素发酵液还原糖的浓度是多少？思考题：1、参考相应生物化学实验手册，详细表述DNS法测定还原糖的原理。2、测定青霉素发酵液的还原糖浓度时，为什么要预先将发酵液中的菌丝体离心分离掉，如果不分离，对测定结果可能会有什么影响？3、为什么要在测定前用硫酸锌和发酵液反应？硫酸锌主要和发酵液中的什么物质反应？4、如果发酵液中所含的还原糖浓度过大，测定的光密度值过大，对测定结果有什么影响，如何避免测定的光密度值过大影响实验测定结果？5、你觉得在用DNS法测定还原糖时，如何减少系统和偶然误差？,综合大实验：还原糖测定,附件1：葡萄糖标线时各试剂用量,附件2：样品中含糖量时测定时试剂用量,开放性试验：青霉素抗菌活性测定,实验原理,抗生素最基本的特性是可以抑制多种微生物的生长，甚至杀死有些微生物。若把它放到含有供试菌的琼脂平板上，则其周围会形成一个圆形的不长菌的透明区域，即抑菌圈。根据此特性可以选择不同的供试菌种，寻找抑制一定的抗生素类型。一般不直接以致病菌作为供试菌，因为可能产生危险，或者由于一些致病菌难以培养；检测抗生素抗菌活性时一般用各种有代表性、非致病性的微生物，初步检测抗生