环境生物工程与技术

环境生物工程与技术,5细胞工程及其在环境污染治理中的应用,1细胞工程基础,细胞工程，是指以细胞为基本单位进行培养、增殖或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生物产品的技术。上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏。下游工程，将已转化的细胞应用到生产实践中去，以生产生物产品的过程。目前细胞工程所涉及的主要技术有：动植物组织和细胞的培养技术、细胞融合技术、细胞器移植和细胞重组技术、体外授精技术、染色体工程技术、DNA重组技术和基因转移技术等。,细胞工程与基因工程的关系,细胞工程的主要技术及其应用,细胞的大小及分类,细胞是细胞工程操作的主要对象。细胞是一切生物最基本的结构单位和功能单位。一个细胞体积的最小极限直径是100nm，支原体是目前发现的最小最简单的细胞。细胞直径的上限可达数百微米，卵细胞不受此限。,各种细胞直径的大小,各类细胞直径的比较,原核细胞和真核细胞的主要区别,细胞周期,无丝分裂：最简单的分裂方式，以横裂或纵裂的方式，一个细胞变为两个细胞。有丝分裂：细胞分裂的主要方式，染色体复制后平均分配到两个子细胞中，包括间期、前期、中期、后期和末期五个阶段；一个间期细胞经过有丝分裂变成两个子细胞。减数分裂：发生在有性生殖细胞中的一种特殊形式的有丝分裂，细胞核和细胞质连续分裂两次，染色体仅复制一次，子细胞染色体数目是原来母细胞的一半。,微生物细胞工程,应用微生物进行细胞水平的研究和生产，包括各种微生物细胞的培养、遗传性状的改造、微生物细胞的直接利用或获得细胞代谢产物等。微生物的培养：包括不同微生物的营养要求以及各种微生物的培养方法发酵工程。遗传性状的改造：原生质体融合、物理或化学诱变、DNA重组等方式改变微生物的遗传性状，获得高产菌株。微生物细胞的应用：应用微生物细胞本身如生产单细胞蛋白，或利用微生物细胞进行有用产物的生产。,微生物原生质体融合技术,能够在不具有接合作用的菌株之间，或对感受态尚不了解的菌株，除去细胞壁后，原生质体之间可以比较容易的进行细胞质融合，进而核融合。对于链霉菌、酵母菌、丝状真菌等，载体转化较为困难，消除细胞壁的原生质体是其应用重组DNA技术的关键环节。,微生物原生质体融合,原生质体及其制备,除去细胞壁，制备原生质体；维持适当的渗透压保持原生质体的稳定性；将原生质体置于高渗再生固体培养基后，再生细胞壁。,渗透压对原生质体的影响,不同微生物细胞的脱壁方法,融合重组,将两亲株的原生质体混合在一起，促进融合，再把融合液涂布在平板上再生，检出重组子。,原生质体再生成细胞,用高渗稳定剂进行稀释，涂布于再生培养基平板上再生，菌落数为原生质体和非原生质化细胞的总合；用水稀释，使原生质体破裂失活，然后涂布于再生培养基平板上再生，菌落数为非原生质化的细胞数。,融合重组的测定,采用染色体标记的遗传重组体检测，重组子应具有两亲株的双重营养缺陷型或者双重抗药性；直接法：将融合液涂布于不补充两亲株生长所需营养物或补充两种药物的再生培养基平板上，直接筛选出原养型或双重抗药性的重组子；间接法：将融合液涂布于营养丰富的再生板上，使亲株和重组子都再生，然后用印影法复制到选择培养基上以检出重组子。,原核细胞的原生质体融合,革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁的比较,革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁成分的比较,革兰氏阳性菌的原生质体融合培养细胞：对数生长中期。收集细胞：离心收集，高渗培养。细胞融合：酶解细胞壁，离心，高渗培养，聚乙二醇促进原生质体融合，高渗稀释。重组子筛选：选择培养基筛选，鉴定。革兰氏阴性菌的原生质体融合肽聚糖层较薄，但结构复杂，含脂质/蛋白质/多糖。溶菌酶处理后仍含部分细胞壁，称为原生质球。,真核细胞的原生质体融合,真菌细胞壁较为复杂，由几丁质/葡聚糖等构成，可用消解酶、蜗牛酶、纤维素酶或几丁质酶等处理；真菌一般为单倍体，融合后形成真正单倍重组体的融合子才能稳定传代，杂合双倍体不稳定；融合过程包括细胞融合形成异核体，不同核融合形成二倍体，融合核交换和重组生成重组体。,植物细胞工程,以植物细胞为基本单位，通过在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按预先设计发生改变，从而改良品种或制造新种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程。植物组织培养技术是一种将植物的组织、器官或细胞在适当的培养基上进行无菌培养，并重新再生细胞或植株的技术，包括植物培养，胚胎培养，器官培养，悬浮细胞培养，原生质体培养。植物细胞和组织培养的理论基础是植物细胞的全能性。,植物细胞与组织的培养方法,固体培养液体培养静止培养振荡培养连续浸没培养定期浸没培养,悬浮细胞培养单细胞培养微室培养平板培养看护培养固定化细胞培养,植物细胞与组织培养物产生的有用物质,利用植物作为生物反应器生产油脂、糖和蛋白质,植物原生质体制备,植物原生质体是植物细胞杂交的良好亲本，也是植物细胞遗传工程的理想受体，还是细胞生物学和分子生物学研究中的重要材料。,植物原生质体的生物学意义,植物原生质体在细胞工程及理论研究中的作用,植物原生质体的制备,植物细胞壁的主要成分是纤维素，半纤维素、果胶质和蛋白质。机械法：高渗处理，质壁分离，捣碎和切割细胞可获得少量脱壁细胞，损伤大，数量少。酶法：纤维素酶。,植物原生质体的培养,细胞壁再生：适当的培养基。分裂：低渗培养基。愈伤组织或胚状体的形成。植株再生。,植物原生质体的融合,也称体细胞杂交。诱导融合的方法物理法：包括显微操作、离心、振动等机械力或电场刺激化学法：各种诱导剂，包括盐、多聚化合物等。膜融合与核融合膜融合分为接触、诱导、融合和稳定四个时期。核融合是原生质体融合的关键步骤。杂合体的选择与鉴别显微镜鉴别，互补法筛选，分子与细胞生物学方法等。,动物细胞工程,动物细胞工程中技术最成熟、影响最大的是细胞融合。动物细胞的培养要模拟体内生理环境进行离体培养。细胞培养在无菌条件下进行，不出现细胞分化和形成组织分为悬浮型细胞培养和贴附型细胞培养。,影响动物细胞体外培养的因素,动物细胞融合,病毒诱导融合，最有效的是副粘病毒。化学诱导融合，聚乙二醇等。电激诱导融合，操作简便、效率高、无残留毒性。,诱导细胞融合的病毒,PEG诱导细胞融合的可能机制,杂种细胞的筛选,单克隆抗体的制备,由同一抗原产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。由特定的B淋巴细胞培养繁殖出的大量遗传性高度一致的细胞群体分泌出的抗体称为单克隆抗体。将B细胞与肿瘤细胞融合，获得的既能产生单一抗体又能在体外无限生长的杂合细胞，称为杂交瘤细胞。,利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体的过程,克隆“多莉羊”细胞融合技术的高峰,2细胞工程在环境污染治理中的应用,细胞融合技术已应用于环境污染物的检测、难降解物质的降解、优良菌种的培育、抗性植物的培养。动物细胞融合技术：生产单克隆抗体检测环境中痕量污染物免疫检测法。植物细胞融合技术：培育抗性植物，抗除草剂。植物修复重金属污染的土壤。微生物细胞融合技术：融合脱氢双香草醛降解菌，提高降解率；融合纤维素分解菌，可同时实现对纤维素的分解；融合降解苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯（不能利用甲苯）及降解苯甲酸酯和甲苯的细菌（不能利用3-氯苯甲酸酯），可实现全部降解及1,4-二氯苯甲酸酯的新降解能力；融合乙二醇降解菌、甲醇降解菌、苯甲酸和苯的降解菌，获得同时降解能力，可用于化纤废水的处理；,抗性植物在生物修复中的作用,植物修复是利用植物的一系列生理、生化过程部分或完全修复和消除被污染土壤、水体和空气中的污染物。植物可通过吸附、吸收及超积累、转移和挥发等方式降解和清除环境中的有毒物质。植物还可与根际微生物协同作用实现对污染物的降解。,植物修复中可能涉及的各种过程,植物对非生物胁迫应答的机制,非生物胁迫因子，特别是干旱和盐分，可导致植物在形态和生理生化代谢上进行一些调整，以适应或忍耐环境胁迫。揭示植物对非生物胁迫应答的机理，发现相关基因，可以应用于植物胁迫耐受的遗传改造，以提高产量、改良作物品质和改善生态环境。,植物对非生物胁迫可能的应答机制,重金属污染的植物修复,适合重金属污染生物修复的植物特征能够超量积累重金属，最好是地上部分积累。对重金属积累浓度有较高的耐受力。生长快，生物量高。易收割。,基因工程设计耐受、积累重金属植物的一般策略,有机污染物的植物修复,几类主要有机污染物、清除这些污染物的植物种类和清除机制,植物去除环境中有机污染物的机理植物直接吸收有机污染物植物根系释放分泌物和酶植物和根际微生物联合作用综合分析污染物的种类、特性和具体环境条件，选择合适的植物种类并制定技术方案。应用转基因技术提高植物降解除草剂的效率。表达人CYP2B6基因的水稻植株对除草剂呋草黄的降解作用提高了至少60倍；共表达大豆CYP71A10和P450还原酶基因的烟草植株，对苯脲型除草剂降解能力提高20-30%。,抗体技术在污染治理中的应用,免疫分析和环境监测欧盟：饮用水中某些有机污染物的浓度0.1g/L抗体片段作为信号分子和传感器的应用监测环境的化学污染监测环境的微生物污染监测食品的变质情况监测水果的储藏和成熟情况监测蔬菜的变质情况相对于色谱和质谱技术，免疫分析技术快速、简单、便宜。,去除微量持久性有机污染物；抗体片段可大规模应用于产品的回收、分离或浓缩，或应用于生物治理要求使用循环免疫亲合技术。,免疫亲合技术处理微污染水,微生物表面展示技术,使表达的外源肽以融合蛋白形式展示在噬菌体或微生物细胞的表面，被展示的多肽或蛋白质保持相对独立的空间结构和生物活性；通过表面展示技术制备细胞表面吸附剂，可应用于重金属污染去除和毒性有机污染物的脱毒，以及生物传感器和金属溶出等方面。,微生物表面展示技术的应用,微生物