生物工程实验

实验一克隆载体重组子的抽提（重组质粒的提取、电泳鉴定及酶切鉴定）,一、实验目的,1、掌握碱裂解法提取质粒DNA。2、掌握质粒的电泳鉴定3、学习质粒的酶切鉴定,1）碱裂解提取质粒原理：主要利用宿主染色体DNA与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离提取的。,二、实验原理,二、实验原理,1）碱裂解提取质粒原理：主要利用宿主染色体DNA与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离提取的。,收集菌体并用GTE悬浮,NaOHSDS,裂解,变性,二者都沉淀,加入KAC,小分子蛋白,大分子不溶性蛋白和残渣,离心分离,取上清,异丙醇沉淀,质粒DNA,苯酚-氯仿除蛋白,获得较纯净质粒,染色体DNA,二、实验原理,2）琼脂糖凝胶电泳：agarosegel电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方法，不同浓度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的DNA片段，在琼脂糖电泳中，DNA迁移的速率不仅与其分子浪的对数值成反比，即分子量越大，移动速率越慢，而且还与分子构型有关。如质粒开环DNA线性DNA共价闭合环状DNA,3）限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子内部的特异序列，并在识别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶，它存在于细菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统即保护自身DNA，限制外源DNA。4-6碱基对，具有回纹结构的DNA片段；水解DNA分子的磷酸二酯键切割方式有两种：黏性末端和平末端切4碱基，平均256bp出现一次切点，切6-8碱基时，每隔4-65kb出现一次切点,二、实验原理,三、实验步骤,1、质粒DNA的提取：在含抗生素、IPTG和X-gal的平板上随机挑出数个白色菌落，接种到5mlLB-AMP液体培养基中，37振荡培养过夜至对数生长期。取1.5ml对数生长期的菌体与EP管中，在台式离心机上8000rpm离心30秒收集菌体。弃上清，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。加100ulGTE缓冲液，用移液器轻轻吹打，使菌体重新悬浮，室温放置5分钟。加入200ulNaOH-SDS溶液，颠倒混匀10次，然后置冰浴5分钟。加入150ul预冷的乙酸钾溶液，充分混匀，置冰浴5分钟。在4下于台式高速离心机12000rpm离心5分钟，并将上清移至另一支新的EP管中。加等体积的酚、氯仿抽提一次，12000rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新的EP管中，加等体积氯仿抽提一次，12000rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新的EP管中。加等体积异丙醇，置冰浴30min，12000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀用70%乙醇0.5ml洗一次，弃上清并真空干燥。用30ulTE溶解沉淀的DNA，加入2ug/ulRnase溶液2ul，3710min，置于4保存。,三、实验步骤,2、琼脂糖凝胶电泳鉴定：DNA电泳时间为30-60min1）用电泳缓冲液制作1.0%的琼脂糖凝胶，冷却至60后加入终浓度0.5ug/ml的EB-紫外下的显色物质2）待胶凝固后，拔出梳子，取出带胶的托盘，一起放入电泳槽，使电泳缓冲液的液面高出凝胶。3）取20ulPCR产物，加入4ul6的上样缓冲液（溴酚蓝），混合后用微量进样器小心加入样品孔。4）以靠近上样端为负极，另一端为正极，接通电源，以5V/cm的电压电泳30-60min。5）电泳结束后，带手套取出凝胶置透明薄膜上，紫外灯下观察结果,三、实验步骤,3、质粒的酶切鉴定：1）质粒DNA酶切反应体系10酶切buffer3l质粒DNA10lEcoR1（10u/l）1lBamH1（10u/l）1lddH2O加至20l37水浴保温1-2h；72水浴15min终止反应。3、电泳检测目的基因片段（电泳方法同前）4、结果分析,四、注意事项,1、抽提质粒过程应尽量保持低温2、质粒制备过程中要尽量除去蛋白，否则会影响后面的酶切或连接3、沉淀DNA常用等体积的异丙醇，但易将盐也沉淀下来，可以用二倍体积的冰乙醇避免盐的沉淀。4、EB是强致癌物，注意操作安全；5、琼脂糖的浓度要根据分离鉴定的DNA的大小不同而配制不同的浓度；6、DNA的纯度对酶切和连接很重要；,五、思考题,1、碱裂解法提取质粒的原理？,实验二目的基因的回收、连接反应（酶切体系的电泳鉴定、回收、纯化、与载体连接）,一、实验目的,1、掌握目的片段的电泳鉴定。2、DNA的胶回收实验3、掌握克隆的原理,二、实验原理,1）琼脂糖凝胶电泳：agarosegel电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方法，不同浓度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的DNA片段，在琼脂糖电泳中，DNA迁移的速率不仅与其分子量的对数值成反比，即分子量越大，移动速率越慢，而且还与分子构型有关。,二、实验原理2）T4DNA连接酶:DNA连接酶是一种封闭DNA链上的缺口的酶，借助于ATP或NAD+水解提供的能量，催化DNA的3-OH与5的磷酸基团生成磷酸二酯健。T4DNA连接酶则连接双链DNA分子的粘性末端或平端。,二、实验原理3）TA克隆;利用Taq酶在延伸过程中会在DNA的末端加A的特性，使PCR扩增产物和带T尾的载体在连接酶的作用下连接起来。,三、实验步骤,1、琼脂糖凝胶电泳鉴定：DNA电泳时间为30-60min1）用电泳缓冲液制作1.0%的琼脂糖凝胶，冷却至60后加入终浓度0.5ug/ml的EB-紫外下的显色物质2）待胶凝固后，拔出梳子，取出带胶的托盘，一起放入电泳槽，使电泳缓冲液的液面高出凝胶。3）取20ulPCR产物，加入4ul6的上样缓冲液（溴酚蓝），混合后用微量进样器小心加入样品孔。4）以靠近上样端为负极，另一端为正极，接通电源，以5V/cm的电压电泳30-60min。5）电泳结束后，带手套取出凝胶置透明薄膜上，紫外灯下观察结果,三、实验步骤,2、DNA的胶回收：切取琼脂糖凝胶上目的片段，称量胶的重量1、按BindingBuffe：PCR产物=4：1比例加入BindingBuffer，混匀；置于50-60水浴10min，使胶彻底融化2、把混合液转移到收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2min，8000rpm离心1min3、倒掉收集管中的废液，加500ulWashSolution到UNIQ-10柱子中，8000rpm室温离心1min4、重复步骤35、倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，12000rpm离心15s6、将UNIQ-10柱放入新的1.5ml离心管中，在柱子膜中央加30ulElutionBuffer或者水，室温或37放置2min7、12000rpm室温离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。,三、实验步骤,3、与载体连接PCR产物克隆试剂盒连接反应体系：10LigationBuffer1ulpUCm-Tvector1ul纯化的PCR产物3ulddH2O3ulT4DNALigase1ulFinalVolume10ul16连接过夜,四、注意事项,1、EB是强致癌物，注意操作安全；2、琼脂糖的浓度要根据分离鉴定的DNA的大小不同而配制不同的浓度；3、DNA的纯度对酶切和连接很重要；,五、思考题,1、T4连接酶与大肠杆菌DNA连接酶作用上有何区别？,实验三感受态细胞的制备、转化、培养,一、实验目的,1、掌握感受态细胞的制备。2、掌握DNA转化过程3、掌握蓝白斑筛选的原理,二、实验原理,1）感受态细胞转化的原理：受体细胞处于感受态即能从环境中吸取DNA的一种生理状态。在冰浴条件先，用0.1M的CaCl2溶液悬浮活化的E.coliDH5a菌，使其膜的通透性增大而成为感受态细胞，当外源重组DNA与感受态细胞混合后在冰浴中孵育后，外源重组质粒DNA就有可能进入感受态细胞内，并通过自我复制实现遗传信息转移，使宿主细胞出现新性状，即感受态细胞转化,2）转化子蓝白斑筛选的原理:使用的载体带有大肠杆菌的DNA短区段，含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息，这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读框，宿主细胞携带编码-半乳糖苷酶C端部分序列，虽然宿主和质粒的片段各自都没有酶活性，但能融为一体，形成具有活性的酶蛋白质-半乳糖苷酶，这种互补现象叫互补，在生色物质X-gal存在下形成蓝色菌落，但在外源基因插入到多克隆位点后，破坏了质粒载体-半乳糖苷基因读框，不能编码-半乳糖苷酶，就形成白色菌落。,二、实验原理,三、实验步骤,1、感受态细胞的制备：1）新活化的E.coliDH5菌平板挑取一单菌落，接种于3-5ml的LB液体培养基中，37振荡培养12小时左右，至对数生长期。2.）上述菌液以1：50量接种到100ml液体培养基中。扩大培养至A600nm=0.7（振荡培养2小时）3）培养液在水浴中冷却片刻后，取1.5ml菌液用冰预冷的1.5ml离心管0-48000rpm离心5min收集菌体。4）去上清，用0.5ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰裕放置，15-30分钟5）0-44000rpm离心10分钟收集菌体6）倾去上清，加入200ul预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞置于冰裕中3-5min后待用转化，或加15-20%的甘油置于-40保存备用。,三、实验步骤,2、重组DNA的转化：1）上述Ep管中加入10ul连接反应混合物，轻轻摇匀，冰裕中放置30分钟。2）再于42水浴中保温90秒，然后迅速在冰裕中冷却3-5分钟。3）加入500ulLB培养液，摇匀后于37温裕30-60分钟。4）将上述转化反应原液涂于含氨苄青霉素、IPTG和X-Gal的LB固体培养基中。5）待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，37培养过夜，观察菌落。,四、注意事项,1、转化实验必须在低温中进行，温度波动严重影响转化效率，所用的试剂均应冰浴，细菌保持在4以下；2、转化实验要做好对照，以检测感受态的细胞和重组质粒；以已知质粒转化感受态细胞做阳性对照；以TE缓冲也转化感受态细胞做阴性对照,五、思考题,1、重组DNA导入原核细胞有哪些方法？2、蓝白斑筛选的原理？,实验四pET-28a-SOD表达重组质粒的鉴定（重组质粒的提取、酶切及电泳鉴定）,一、实验目的,1、学习掌握重组子的筛选与验证2、掌握碱裂解法提取质粒DNA。3、掌握质粒的酶切电泳鉴定,1）碱裂解提取质粒原理：主要利用宿主染色体DNA与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离提取的。,二、实验原理,二、实验原理,1）碱裂解提取质粒原理：主要利用宿主染色体DNA与质粒DNA之间的结构和大小的差异进行分离提取的。,收集菌体并用GTE悬浮,NaOHSDS,裂解,变性,二者都沉淀,加入KAC,小分子蛋白,大分子不溶性蛋白和残渣,离心分离,取上清,异丙醇沉淀,质粒DNA,苯酚-氯仿除蛋白,获得较纯净质粒,染色体DNA,二、实验原理,2）琼脂糖凝胶电泳：agarosegel电泳是分离鉴定和纯化DNA分子的常用方法，不同浓度的琼脂糖胶可分离100bp-60kb的DNA片段，在琼脂糖电泳中，DNA迁移的速率不仅与其分子浪的对数值成反比，即分子量越大，移动速率越慢，而且还与分子构型有关。如质粒开环DNA线性DNA共价闭合环状DNA,3）限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子内部的特异序列，并在识别位点或其周围产生切割作用的核酸水解酶，它存在于细菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统即保护自身DNA，限制外源DNA。4-6碱基对，具有回纹结构的DNA片段；水解DNA分子的磷酸二酯键切割方式有两种：黏性末端和平末端切4碱基，平均256bp出现一次切点，切6-8碱基时，每隔4-65kb出现一次切点,二、实验原理,实验步骤-PET-28a-Mn-SOD表达重组质粒的鉴定,1、用灭菌牙签分别挑取5个菌落接种到2mlLB-Km（50ug/ml）液体培养基中，37振荡培养过夜；2、用碱裂解法提取质粒；3、用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切质粒，1.0%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果：切出600bpMn-SOD基因DNA片段的为阳性克隆。,流程图,三、实验步骤,一、质粒DNA的提取：1.在含抗生素、IPTG和X-gal的平板上随机挑出数个白色菌落，接种到5mlLB-AMP液体培养基中，37振荡培养过夜至对数生长期。2.取1.5ml对数生长期的菌体与EP管中，在台式离心机上8000rpm离心30秒收集菌体。3.弃上清，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。4.加100ulGTE缓冲液，用移液器轻轻吹打，使菌体重新悬浮，室温放置5分钟。5.加入200ulNaOH-SDS溶液，颠倒混匀10次，然后置冰浴5分钟。6.加入150ul预冷的乙酸钾溶液，充分混匀，置冰浴5分钟。7.在4下于台式高速离心机12000rpm离心5分钟，并将上清移至另一支新的EP管中。加等体积的酚、氯仿抽提一次，12000rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新的EP管中，加等体积氯仿抽提一次，12000rpm离心5分钟，取上层水相至另一支新的EP管中。8.加0.6倍体积异丙醇，置冰浴30min，12000rpm离心10分钟，弃上清。9.沉淀用70%乙醇0.5ml洗一次，弃上清并真空干燥。用30ulTE（已加入2ug/ulRnase）溶液溶解沉淀的DNA，3710min，置于4保存。,三、实验步骤,3、质粒的酶切鉴定：1）质粒DNA酶切反应体系10酶切buffer3l质粒DNA10lEcoR1（10u/l）1lBamH1（10u/l）1lddH2O加至20l37水浴保温1-2h；72水浴15min终止反应。3、电泳检测目的基因片段（电泳方法同前）4、结果分析,三、实验步骤,2、琼脂糖凝胶电泳鉴定：DNA电泳时间为30-60min1）用电泳缓冲液制作1.0%的琼脂糖凝胶，冷却至60后加入终浓度0.5ug/ml的EB-紫外下的显色物质2）待胶凝固后，拔出梳子，取出带胶的托盘，一起放入电泳槽，使电泳缓冲液的液面高出凝胶。3）取20ulPCR产物，加入4ul6的上样缓冲液（溴酚蓝），混合后用微量进样器小心加入样品孔。4）以靠近上样端为负极，另一端为正极，接通电源，以5V/cm的电压电泳30-60min。5）电泳结束后，带手套取出凝胶置透明薄膜上，紫外灯下观察结果,四、注意事项,1、抽提质粒过程应尽量保持低温2、质粒制备过程中要尽量除去蛋白，否则会影响后面的酶切或连接3、沉淀DNA常用等体积的异丙醇，但易将盐也沉淀下来，可以用二倍体积的冰乙醇避免盐的沉淀。4、EB是强致癌物，注意操作安全；5、琼脂糖的浓度要根据分离鉴定的DNA的大小不同而配制不同的浓度；6、DNA的纯度对酶切和连接很重要；,五、思考题无,实验四(续)pET-28a-SOD表达重组质粒的鉴定（重组质粒的提取、酶切及电泳鉴定）,1、菌落PCR扩增目的片段-初步鉴定表达转化子的正确2、电泳鉴定目的条带的存在否？3、验证正确后用于诱导表达目的蛋白,实验六重组蛋白的诱导,一、实验目的,1、学习目的蛋白诱导表达的原理。2、掌握接种、培养定时取样、蛋白的提取分离纯化3、掌握目的蛋白的分离鉴定方法,二、实验原理,1）诱导表达的原理：pET系统也是在大肠杆菌E.coli中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统。目的基因的表达受噬菌体T7强转录及翻译信号的调控。表达系统是以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计的，lac操纵子的转录受正调控因子CAP和负调控因子lacI的调控，在无诱导物情况下，lacI形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始，在IPTG(-D-硫代半乳糖苷)等乳糖类似物是lac操纵子的诱导物，它与阻遏蛋白结合使之改变构象，导致其与操纵基因的结合而解离出来。Lac操纵子的转录因此激活。Lac操纵子具有可诱导调控基因转录的性质，因此用来构建到表达载体中。PET28就有lacI基因，可用IPTG诱导。,三、实验方法,一、PET-28a-Mn-SOD表达重组质粒的诱导表达（1）用灭菌牙签分别挑取阳性克隆和1个含PET-28a表达质粒菌落接种到2mlLB-Km（50ug/ml）液体培养基中，37振荡培养过夜；（2）按1：10接种到3mlLB-Km（50ug/ml）液体培养基中，37250rpm振荡培养2小时（OD值约为0.2-0.6）；（3）于各管中加100mMIPTG30ul（终浓度为1mM），37250rpm振荡培养，分别在1小时、2小时和3小时各取1ml菌液，6000rpm离心2分钟收集菌体，用2mlPBS重悬菌体，加10mg/ml溶菌酶至终浓度为0.3mg/ml，冰上放置30分钟，加入10%TritonX-100（终浓度为0.1%），混匀，超声（200W3秒,间隔3秒，60次）破碎细菌至细菌悬液变的清亮透明，12000rpm离心10分钟，收集上清和沉淀待用。,（4）取上清和沉淀分别加等体积2蛋白上样液，沸水浴5分钟变性，SDS-PAGE（12%的分离胶）电泳，考马斯亮蓝染色分析，见图2。（5）结果：发现分子量约为30KD，IPTG诱导3小时时重组蛋白表达量最高，约占总蛋白的50%，将3号菌种接种到另一含卡那霉素的LB固体培养基上并用15%甘油保种。,参考内容,5SDS上样缓冲液10ml1.0mol/LTrisHCl（pH6.8）0.6ml2-巯基乙醇0.5ml10%SDS2.0ml1%溴酚蓝1.0ml50%甘油5.0mlDTT300mM去离子水0.9ml（混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存）考马斯亮蓝染液1000ml考马斯亮蓝R-2501.0g甲醇450ml冰醋酸100ml去离子水450ml考马斯亮蓝脱色液1000ml甲醇100ml冰醋酸100ml,蛋白样品的电泳检测（SDS-PAGE）1）用洗衣粉轻轻擦洗玻璃板，两面都擦洗过后用自来水冲，再用去离子水冲洗干净后晾干备用。2）灌胶与上样。将玻璃板对齐后放入制胶板中卡紧，加入去离子水试漏，若不漏将水倒干净。3）配12的分离胶，加入TEMED后立即摇匀，马上注入两玻璃板中。灌胶时，可用1ml微量加样器沿玻璃一侧缓缓倾注以防气泡产生，待胶面升到离玻璃板口2cm-3cm时即可。4）然后胶上加一层水赶走气泡，且起到封闭的作用，水封后胶凝得更快并且胶面更平（灌胶时开始可以动作快一些，胶面快到所需高度时放慢速度。加水封胶面时要慢，否则胶会被冲变型而且会使水混入胶内改变胶的浓度）。,蛋白样品的电泳检测（SDS-PAGE）5）放置约50min左右，当水和胶之间有一条折射线时，或者灌胶剩下的胶液已经凝固了，说明胶已凝固完好。这时轻轻倾斜胶板倒去上面的水样。6）按上述方法配5的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀，迅速灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，迅速将梳子水平插入浓缩胶中。由于胶凝固时体积会收缩减小，减小加样孔的上样体积，所以在浓缩胶凝固的过程中要在两边补胶。约30-50min后，待浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。7）将胶板放入电泳槽中，加入足够的电泳缓冲液（电泳缓冲液至少要漫过内测的小玻璃板），用微量加样器的Tip插至加样孔中缓慢加入样品，并同时加入蛋白Marker（加样不要太快，太快可使样品冲出加样孔，如果有气泡可能会使样品溢出）。,蛋白样品的电泳检测（SDS-PAGE）8）接通电源电泳，电泳时间一般23h，调节电压为：浓缩胶用80-100V，到分离胶以后加大到120-150V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。9）染色：小心将胶削离，放入盛有考马斯亮蓝（20ml已足够）较大容器内，对于0.75mm的胶可在摇床上缓慢震荡5-10min，对于1.5mm的胶则需要10-20min。10）弃去染液，将胶在水中漂洗数次后，放入考马斯亮蓝脱色液中（约50ml），在摇床上缓慢震荡约1h，清晰条带很快会显现出来。11）将胶放入扫描仪中扫描拍照。,四、注意事项,1、SDS-PAGE胶含有丙烯酰胺等有毒化合物物，注意操作安全；2、胶的浓度要根据分离鉴定蛋白的大小不同而配制不同的浓度(有一表格)；3、看清梳子插孔上样，注意梳子孔不要倒，倒下的，用上样针拨起；,五、思考题,实验七重组蛋白免疫印迹分析,一、实验目的,1、学习目的蛋白表达鉴定的原理。2、掌握蛋白的SDS-PAGE、胶的制作、染色、脱色鉴定的方法3、掌握目的蛋白WesternBlot鉴定方法,二、实验原理,1）实验原理：经过SDS-PAGE蛋白质样品，转移到固相载体硝酸纤维素膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及生物学活性不变。以固相载体上的蛋白或多肽作为抗原与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体结合，经过底物显色或放射自显影以检查电泳分离的特异性目标蛋白,同样样品同时上样到两块胶上，同时电泳，一块胶染色，一块胶转膜westernblot,三、实验方法,一、转膜（1）切除凝胶多余的边缘部分，用直尺量出胶的长与宽，估算面积，将胶浸入转移到缓冲液中平衡10min(摇床)（2）剪切8张与胶同样大小的滤纸和一张硝酸纤维膜，均用转移缓冲液平衡10min（摇床上）；（3）从电极负极到正极依次顺序为：海绵滤纸一层电泳凝胶硝酸纤维膜-三层滤纸海绵，操作时不要有气泡夹在里面，固定好后放入电泳槽中，接通电源。转移30-45min,三、实验方法,二、封闭转膜结束，关闭电源，取出硝酸纤维膜，将膜浸入封闭液中摇床上缓慢震荡30min三、加一抗将膜用PBST洗3次，5min/次，然后加入已作稀释的一抗，37震荡1h，或室温缓慢震荡2h，或4过夜。四、加酶标二抗用PBST洗膜3次，5min/次，然后加入酶标二抗，37震荡1h，或室温缓慢震荡2h。五、显色用PBST洗膜3次，5min/次，然后将膜浸入到底物液中，轻轻晃动数秒后避光静止，待特异性条带清晰显现时换ddH2O以终止反应。,四、注意事项,1、接触硝酸纤维膜时要带手套2、转移电流不能太大以免产热过多，影响条带清晰度；3、封闭液中有小牛血清、脱脂奶粉等，若封闭液中含有能与一抗结合的蛋白，就要避免使用这种封闭液,五、思考题,生化工程学实验,一、实验目的(1)通过超氧化物歧化酶的分离纯化,了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换层析方法的原理。(2)掌握测定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。二、原理超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)简称SOD,它广泛存在于各类生物体内,按其所含金属离子的不同,可分为3种:CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。SOD催化如下反应:O2.-+O2-+2H+H202+02-自由基清除剂,实验一、SOD酶粗酶液的分离纯化,分离纯化的原理（1）Mn-SOD易溶于乙醇；（2）K2HP04极易溶于水；（3）极性有机溶剂丙酮沉淀SOD;(4)纤维素阴离子交换柱纯化。,X,Z,Z,X,X,X,Y,Z,Y,Z,XOH,nX,平衡上样,吸附,洗杂,洗脱,离子交换法,（2）根据分子电离性质的差异性进行分离。如离子交换法，电泳法，等电聚焦法。,三、实验步骤：1、粗酶液的获得：收集50mL发酵液菌体，离心收集菌体。15mL磷酸钾缓冲液重悬菌体，并加入75ulTriton冰上裂解菌体10min，超声破碎（400w,5-3,90次），8000rpm离心10，上清即为SOD粗酶液,取上清12ml（留样1mL测酶活和蛋白含量-A）。2、氯仿去蛋白：上清中缓慢加入1/4体积的4下预冷过的95%乙醇3mL,然后再缓慢加入在4下预冷过的氯仿1.8mL(0.15倍体积),充分搅拌,8000rpm离心10min,弃去沉淀,收集上清液约10mL(留样0.5mL测酶活和蛋白含量-B)。3、K2HP04去水：加入K2HP043H20(按43gk2HP043H20/100mL粗提液的比例),约4g充分振摇，静止分层，收集上层，离心8000rpm，10min,弃沉淀,得上清液约8mL(留样0.5mL测酶活和蛋白含量-C),4、丙酮沉淀蛋白并透析：上一步得到的上清液加入0.75倍体积在4下预冷过的丙酮,Mn-SOD便沉淀下来。离心8000rpm，10min,收集灰白色沉淀物。将沉淀物溶于约3mLddH2O中,在4下,对250mLpH7.6,2.5mmol/L的磷酸钾缓冲液透析,每隔20以上,换透析外液1次,共换2-3次。透析内液如出现沉淀,需8000rpm，10min,弃去沉淀,收集上清液约5ml(留样0.3mL-D)。5、DE-52纤维素柱层析：将上一步所得离心上清液过DE-52纤维素柱。用pH7.6,2.5mmol/L磷酸钾缓冲液作层析柱平衡液,用pH7.6,2.5mmol/L(100mL)-200mmol/L(l00mL)的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱。流速30mL/h,每管收集3mL,记录总体积。,实验二、SOD蛋白浓度及酶活测定,一、实验目的掌握蛋白含量和SOD酶活性的测定方法。二、原理酶的比活性用每毫克蛋白质具有的活性单位来表示，因此，测定样品的比活性必须测定：（1）每毫升样品中的蛋白质毫克数。（2）每毫升样品中的酶活性单位数。SOD测定方法采用邻苯三酚自氧化法:邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物。中间物在420nm波长处有强烈光吸收,当有SOD存在时,由于它能催化O2-与H+结合生成02和H202,从而阻止了中间物的积累,因此,通过计算就可求出SOD的酶活性。,非变性电泳分离胶配方,非变性电泳浓缩胶配方,三、实验步骤,1.测蛋白标准曲线的绘制（1）蛋白标准样0.4mg/ml：,立即混匀，室温放置2-3分钟，595nm比色，空白管调零。（2）计算出各阶段样品的蛋白浓度。,三、实验步骤,1.卡马斯亮蓝法测蛋白（1）取7只试管，编号，按下表操作：,立即混匀，室温放置2-3分钟，595nm比色，空白管调零。（2）计算出各阶段样品的蛋白浓度。,三